Isolamento e caracterização de bactérias ruminais com alta atividade específica de produção de amônia | Isolation and characterization of rumen bacteria with high specific activity of ammonia production

Os objetivos deste trabalho foram avaliar a produção de amônia em bovinos alimentados com dietas contendo níveis crescentes de proteína bruta e averiguar o impacto da dieta sobre a diversidade genética do ecossistema ruminal; isolar e caracterizar fisiológica e geneticamente bactérias ruminais com alta atividade específica de produção de amônia e determinar o efeito de monensina e bovicina HC5 sobre a atividade de desaminação dos isolados bacterianos hiperprodutores de amônia. A produção total de amônia e a atividade específica de produção de amônia (AEPA) de culturas mistas e puras obtidas a partir do líquido ruminal de animal submetido a dietas contendo níveis crescentes de proteína foram analisadas. As culturas foram incubadas em meio mineral anaeróbio contendo Trypticase (15 g/L) e a atividade de desaminação foi determinada. A diversidade genética da microbiota ruminal do animal alimentado com dieta contendo concentrações crescentes de proteína e das culturas de enriquecimento transferidos in vitro na presença de Trypticase foi analisada por Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Verificou-se que a habilidade de desaminar aminoácidos variou entre as culturas de bactérias ruminais colhidas de bovino alimentado com 8, 18 e 24 % de proteína bruta (PB). Alíquotas de líquido ruminal que foram diluídas sucessivamente (incrementos de 10 vezes) apresentaram menor atividade de desaminação de Trypticase. A AEPA decresceu linearmente com a diluição da microbiota ruminal, tendo sido inferior a 10 nmoles de amônia/mg proteína/min após a diluição 10-4 (8 e 18% de PB) ou 10-5 (24 % de PB). A análise da diversidade genética da microbiota ruminal pela técnica de DGGE não indicou mudanças significativas na composição da comunidade microbiana entre o primeiro e o último dia de alimentação com cada dieta. Para as transferências a partir da dieta com 8%, 18 % e 24 % de PB, observou-se variação nos perfis de bandas correspondentes às diferentes espécies microbianas presentes nas amostras. A cultura oriunda da dieta contendo 24% de PB foi a que apresentou maior produção de amônia e adaptação mais rápida a Trypticase. Bactérias que apresentaram alta atividade específica de produção de amônia foram isoladas e parâmetros metabólicos foram avaliados. As estratégias de isolamento utilizadas permitiram a obtenção de quatorze isolados (culturas 27B, 35, 53P, 57A, 86A, 86C, 92B, 99A, 102, 102B, 103, 15A, 15B e CT2) com alta atividade específica de produção de amônia. Esses microrganismos foram caracterizados como bastonetes gram-positivos, capazes de produzir esporos termoresistentes e de crescerem em condições de anaerobiose. Os resultados obtidos indicaram que os isolados se diferenciam quanto à taxa de desaminação e velocidade de crescimento em meio contendo Trypticase. Entretanto, foi observado que esses isolados compartilharam características culturais e produtos de fermentação comuns. As análises bioquímicas dos microrganismos relacionados nesse trabalho mostraram que vários isolados foram capazes de fermentar carboidratos. Quando os isolados foram incubados com aminoácidos, verificou-se alta atividade específica de produção de amônia a partir de fenilalanina, glutamina, Isoleucina, leucina, serina, tirosina e treonina. A análise da diversidade genética dos quatorze isolados com alta atividade específica de produção de amônia pela técnica de BOX-PCR resultou em padrões de bandas distintos entre os isolados e culturas hiperprodutoras de amônia previamente descritas na literatura. Com base nos dados do seqüenciamento do rDNA 16S foi determinado que os isolados 57A, 86A, 99A, 102 e 15A apresentaram identidade de 96 %, 99 %, 93 %, 94 % e 99 % respectivamente, com Clostridium botulinum e o isolado RF2B, oriundo de fezes de suíno, porém ainda não caracterizado. Os isolados 15B e CT2 apresentaram identidade de 94 % e 88 % respectivamente com Clostridium hastiforme. A sensibilidade da microbiota ruminal e dos isolados hiperprodutores de amônia do rúmen à bacteriocina bovicina HC5 e ao ionóforo monensina foi avaliada e os resultados demonstraram que bovicina HC5 inibiu a produção de amônia pela microbiota ruminal e pelos isolados hiperprodutores de amônia caracterizados neste trabalho. Considerando os resultados obtidos neste trabalho, infere-se que microbiota ruminal de bovinos de clima tropical apresentam bactérias com alta atividade específica de produção de amônia relacionadas ao gênero Clostridium que podem contribuir para as perdas de nitrogênio dietético no rúmen.

The objectives of this study was to evaluate the production of ammonia in cattle fed diets containing increasing levels of crude protein and investigate the impact of diet on the genetic diversity of the rumen ecosystem, isolate and characterize physiological and genetically rumen bacteria with high specific activity, production ammonia and determine the effect of monensin and bovicina HC5 on deamination of the bacterial isolates hiperprodutores ammonia.The total production of ammonia and specific activity of ammonia production (SAAP) of pure and mixed cultures obtained from the rumen of animals fed diets containing increasing levels of protein were analyzed. Cultures were incubated in anaerobic mineral medium containing Trypticase (15 g/L) and deamination was determined. The genetic diversity of the rumen microflora of the animal fed a diet containing increasing concentrations of protein and the enrichment cultures transferred in vitro in the presence of Trypticase was analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). It was found that the ability of deaminated amino acids varied between the cultures of ruminal bacteria harvested from cattle fed with 8, 18 and 24% crude protein (CP). Aliquots of rumen fluid were diluted successively (increments of 10 times) reduced deamination of Trypticase. The SAAP decreased linearly with the dilution of the rumen microbiota, was less than 10 nmoles ammonia / mg protein / min after dilution 10-4 (8 and 18% CP) or 10-5 (24% CP). Analysis of genetic diversity of the rumen microbiota by DGGE technique did not indicate significant changes in microbial community composition between the first and last days of feeding with each diet. For transfers from the diet with 8, 18 and 24% CP, there were changes in the profiles of bands corresponding to different microbial species present in the samples. The culture originated from the diet containing 24% CP showed the highest production of ammonia and adapt more quickly to Trypticase. Bacteria that showed high specific activity of ammonia production were isolated and metabolic parameters were evaluated. The strategies used in isolation has been obtained from fourteen isolates (cultures 27B, 35, 53P, 57A, 86A, 86C, 92B, 99A, 102, 102B, 103, 15A, 15B and CT2) with high specific activity of ammonia production. These organisms were characterized as Gram-positive, capable of producing heat-resistant spores and grow under anaerobic conditions. The results indicated that the isolates differ in the rate of deamination and growth rate in medium containing Trypticase. However, it was observed that these isolates shared cultural characteristics and fermentation products in common. The biochemical analysis of microorganisms involved in this work showed that several isolates were able to ferment carbohydrates. When the isolates were incubated with amino acids, there was high specific activity of ammonia production from phenylalanine, glutamine, isoleucine, leucine, serine, tyrosine and threonine. Analysis of genetic diversity among fourteen isolates with high specific activity of ammonia production by the technique of BOX-PCR resulted in different band patterns among the isolates and cultures hiperprodutoras ammonia previously described in the literature. Based on data from the sequencing of 16S rDNA was determined that the isolates 57A, 86A, 99A, 102 and 15A showed identity of 96%, 99%, 93%, 94% and 99% respectively with Clostridium botulinum and isolated RF2B, coming feces of pigs, but not yet characterized. Isolates 15B and CT2 had 94% identity and 88% respectively with Clostridium hastiforme. The sensitivity of rumen microbes and isolated hiperprodutores ammonia rumen bacteriocin bovicin HC5 and the ionophore monensin was evaluated and the results showed that bovicin HC5 inhibited the production of ammonia by ruminal microbes and the isolated hiperprodutores ammonia characterized in this work. Considering the results obtained in this study, it appears that ruminal microbes of cattle tropical bacteria present with high specific activity of ammonia production related to the genus Clostridium that may contribute to the loss of dietary nitrogen in the rumen.

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