Identification of essentially derived varieties in maize (Zea mays L.) using molecular markers, morphological traits, and heterosis

Das in der UPOV-Konvention festgelegte „Züchterprivileg“ sichert allen Züchtern die freie Verwendung von geschützten Sorten zur Schaffung neuer genetischer Variation und ist damit Garant für nachhaltigen Zuchtfortschritt. Da das Züchterprivileg jedoch auf verschiedene Weise unterlaufen werden kann, z. B. bei Re-Selektion innerhalb von geschützten Sorten, fortgesetzter Rückkreuzung zu geschützten Sorten, oder durch punktuelle gentechnische Veränderungen geschützter Sorten, wurde von der UPOV 1991 das Konzept der „abgeleiteten Sorten“ (essentially derived varieties, EDVs) eingeführt, um diesen Missbrauch zu verhindern. Eine Sorte ist demnach von einer Ausgangssorte abgeleitet, wenn (i) die Sorte sich zumindest in einem Registermerkmal von der Ausgangssorte unterscheidet, (ii) der Züchter die Sorte hauptsächlich aus der Ausgangssorte entwickelt hat und (iii) die Sorte weitestgehend genetisch identisch ist mit der Ausgangssorte. Hauptziel dieser Arbeit war es, bei Mais verschiedene Methoden zur Feststellung der genetischen Übereinstimmung zwischen Ausgangssorte und potentiellen EDVs zu untersuchen und miteinander zu vergleichen, um eine theoretische und experimentelle Basis zur Festlegung von Grenzwerten zur Unterscheidung von EDVs und unabhängigen Sorten zu erarbeiten. Im Vordergrund stand dabei die Evaluierung von genetischen Distanzen (GDs) basierend auf molekularen Markern, wie „simple sequence repeats“ (SSRs) und „amplified fragment length polymorphisms“ (AFLPs) sowie Faktoren, welche die GD zwischen Eltern und Nachkommen bestimmen. Ebenso wurde die Möglichkeit untersucht, morphologische Merkmale oder Heterosis zur Bestimmung von EDVs zu verwenden. Einzelziele der Arbeit waren: (1) die Bestimmung der Variation des Genombeitrags von Elternlinien zu ihren Nachkom¬menlinien; (2) die Unterscheidung von Maisinzuchtlinien aus F2-, BC1- und BC2-Nachkommenschaften anhand von SSR- und AFLP- basierten GDs sowie morphologi¬schen Merkmalen und Heterosis; (3) die Verifikation von theoretischen und simulierten Daten aus einer Begleitstudie und (4) die Bewertung der Ergebnisse im Hinblick auf verschiedene in der Literatur vorgeschlagene EDV-Grenzwerte. Insgesamt wurden 220 Flint-, Dent- und US-Maisinzuchtlinien mit 100 gleichmä-ßig über das Maisgenom verteilten SSRs genotypisiert. Darunter befanden sich 163 Triplets bestehend aus einer Nachkommenlinie und beiden Elternlinien, wobei erstere ent-weder aus einer F2-, BC1-, oder BC2- Population entwickelt wurde. Ein Teilsatz aus 58 Linien (38 Triplets) wurde zusätzlich mit 20 AFLP-Primerkombinationen genotypisiert. In einem dreiortigen Feldexperiment über zwei Jahre wurden darüber hinaus morphologische Merkmale und Heterosis für diese 38 Triplets erfasst. Sowohl bei simulierten als auch bei experimentellen Daten wurden Überlappungen zwischen den GD-Verteilungen von F2- und BC1- abgeleiteten Linien zu ihren Eltern gefunden. Unter der Annahme, dass die Ableitung einer Linie aus einer F2-Population ein ak-zeptiertes Verfahren wäre, die Ableitung aus einer BC1-Population jedoch nicht akzeptabel, wurde bei einem angenommenen Fehler 1. Art (α) von 0,05 je nach Genpool und ver-wendetem Markersystem ein Fehler 2. Art (β) von 0,23 bis 0,37 festgestellt. Für einen Grenzwert zwischen BC1 und BC2 liegt β zwischen 0,40 und 0,60 mit steigender Tendenz für höhere BC-Generationen. Für die in der Literatur vorgeschlagenen fixen Grenzwerte von T=0,25, 0,20, 0,15, und 0,10 wurden beträchtliche Differenzen für α und β zwischen verschiedenen Genpools gefunden, was die Anwendung genpoolspezifischer Grenzwerte nahe legt. Ebenso sollten spezifische Grenzwerte für potentielle EDVs aus intra-pool Kreuzungen gegenüber inter-pool Kreuzungen entwickelt werden. Die Trennung von F2-, BC1- und BC2-abgeleiteten Nachkommenlinien auf der Ba-sis von morphologischen Distanzen und Heterosis ergab für α=0,05 β-Werte zwischen 0,50 und 0,95 je nach Merkmal bzw. Merkmalskombination. Sie erwies sich somit als wenig geeignet zur Identifikation von EDVs, da die F2 -, BC1- und BC2-Verteilungen deutlich stärker überlappten als die mit Marker ermittelten GDs. Generell erwiesen sich SSRs und AFLPs als am besten geeignet, enge Verwandt-schaftsbeziehungen zwischen Maisinzuchtlinien aufzudecken und zwischen Linien zu un-terscheiden, die mittels akzeptierten bzw. nicht akzeptierten Zuchtverfahren erstellt wur-den. Die in dieser Studie vorgestellten Ergebnisse können somit als exemplarisch für die Identifikation von EDVs betrachtet werden und können durch Adjustierung der entsprechenden Schwellenwerte auf andere diploide Kulturarten übertragen werden.

The ‘breeder’s exemption’ as fixed in the UPOV convention on plant variety protec-tion allows the use of protected germplasm for the development of new plant varieties. The aim of this concept is the creation of new genetic variation to guarantee a continuous breeding progress. However, the use of molecular markers in backcrossing programs and genetic engineering has created the technical basis to develop new plant varieties without original breeding efforts. Therefore, the concept of ‘essential derivation’ was implemented into the 1991 Act of the UPOV convention to distinguish between varieties that resulted from intensive and creative selection programs and cultivars that were developed without major genetic changes from these former varieties. Accordingly, a variety is deemed to be essentially derived from an initial variety (IV), if it (i) was predominantly derived from the IV, (ii) is clearly distinguishable from the IV, and (iii) genetically conforms to the IV in the expression of it’s essential characteristics. The goal of this thesis was to evaluate and compare different approaches to assess conformity in the expression of the essential characteristics between IV and essentially derived varieties (EDVs) and to derive a theoretical and experimental basis for the devel-opment of thresholds to distinguish between independently derived varieties and EDVs in maize (Zea mays L.). The main focus was set on the evaluation of genetic distances based on ‘simple sequence repeats’ (SSRs) and ‘amplified fragment length poly¬morphisms’ (AFLPs) as well as the factors contributing to the GD between parental inbreds and their progeny lines. Furthermore, the ability of heterosis and morphological distances for identification of EDVs was examined. In detail, the objectives were to (1) analyze the factors influencing genetic distances (GD) based on SSRs and AFLPs between related maize inbred lines, (2) investigate the power of SSR- and AFLP-based GD estimates, morphological distances and heterosis for discriminating between progenies derived from F2, BC1, and BC2 populations, (3) exemplify theoretical and simulated results with experimental data, and (4) draw conclusions with regard to EDV thresholds suggested in the literature. A total of 220 flint, dent, and US maize inbred lines was genotyped with 100 SSRs equally distributed across the maize genome. The 220 lines comprised 163 triplets. A triplet consisted of one progeny and both parental lines, where the former was developed from an F2-, BC1-, or BC2 population. A subset of 58 lines (38 triplets) was genotyped addition-ally with 20 AFLP primer combinations. Furthermore, morphological traits and heterosis were observed for these 38 triplets in a field experiment over two years and three locations. The distributions of GD values for parental lines and their F2- and BC1-derived progeny overlapped for simulated as well as for experimen-tal data. Assuming that the derivation of a line from an F2 population was an accepted breed-ing procedure and the derivation from a BC1 population would not be accepted, we ob-served Type II errors (β) ranging from 0.23 to 0.37 depending on the germplasm pool for a given Type I error (α) of 0.05. For a threshold between BC1 and BC2, β ranged from 0.40 to 0.60 with an increasing tendency for higher BC levels. For fixed GD thresholds of T=0.25, 0.20, 0.15, and 0.10 suggested in the literature, substantial differences for α and β were found between different germplasm pools. Therefore, thresholds need to be gene pool specific and different thresholds for potential EDVs from intra-pool crosses than for progenies from inter-pool crosses must be applied. Discrimination of F2-, BC1-, and BC2-derived progeny lines on the basis of heterosis and morphological distances revealed β values ranging from 0.50 to 0.95 depending on the trait or combination of traits. Therefore, heterosis and morphological distances were fairly inappropriate tools for identification of EDVs due to the larger overlaps of F2-, BC1-, and BC2-distributions compared to GDs based on molecular markers. In general, SSRs and AFLPs were the most adequate tools to uncover close pedigree relationships between maize inbred lines and to discriminate among lines derived with ac-cepted or non-accepted breeding procedures. Therefore, the results presented in this study provide an example for identification of EDVs and can be transferred to other diploid crops by adjusting the corresponding thresholds.