Drought stress response of tetraploid hybrid aspen (Populus tremula L. x P. tremuloides Michx.) of protoplast fusion experiments)

Pappelsorten (Populus) für den Anbau in Kurzumtriebsplantagen sollten neben einer hohen Biomasseproduktion und der Vermehrbarkeit über Steckhölzer auch Trockentoleranz aufweisen. Trockenheit stellt einen wichtigen abiotischen Stressor dar, der das Wachstum der Pflanze, ihre Vitalität und ihre Produktivität negativ beeinflussen kann. Polyploide Sorten von Getreidepflanzen (Triticum), krautigen Pflanzen (Lonicera, Spathiphyllum und Nicotiana) aber auch Baumarten (Betula) zeigen eine höhere Toleranz gegenüber Stress, wie z.B. Trockenstress, im Vergleich zu Sorten mit niedrigerem Ploidiegrad. Hybridaspen Populus tremula (L.) x P. tremuloides (Michx.) der Sektion Populus können auch auf Grenzertragsböden ökonomische Zuwächse verzeichnen, auf denen andere Baumarten ausfallen. Den Hybridaspen fehlt allerdings die Vermehrbarkeit über Steckhölzer. Anderen Pappelarten der Sektionen Tacamahaca und Aigeiros wie beispielsweise P. nigra (L.) and P. trichocarpa (Torr. & Gray) x P. deltoides (Bartram ex Marsh) zeigen diese entscheidende Eigenschaft. Da Kreuzungen zwischen den Sektionen Populus und Tacamahaca oder Aigeiros auf natürlichem Weg schwierig sind, wurde die Methode der somatischen Hybridisierung eingesetzt. Der Klon P. tremula x P. tremuloides ('Münden 2') wurden als ein Fusionspartner und einer der Klone P. x canescens (INRA clone No. 717 1‑B4), P. nigra oder P. trichocarpa x P. deltoides (B19) als zweiter Fusionspartner in Hybridisierungsexperimenten verwendet. Blattmorphologisch und durch Mikrosatellitenanalysen konnten die erhaltenen Fusionsprodukte dem Ausgangsklon P. tremula x P. tremuloides ('Münden 2') zugeordnet werden, wiesen dabei aber einen tetraploiden Chromosomensatz auf. In der vorliegenden Dissertation war das zentrale Ziel, Trockenstressreaktionen tetraploider Hybridaspenlinien (HAL) im Vergleich zur diploiden Ausgangslinie P. tremula x P. tremuloides ('Münden 2') zu untersuchen. Dazu wurden die folgenden Fragen aufgestellt. (i) Sind die tetraploiden HAL dem diploiden Ausgangsklon unter Trockenheit überlegen z.B. hinsichtlich des Wasserverbrauchs und des Verwelkungs- und Vertrocknungszeitpunktes der Blätter? (ii) Unterscheiden sich die tetraploiden HAL von dem diploiden Ausgangklon in morphologischen Ausprägungen wie beispielsweise der Stomatamorphologie, der Höhe, der Biomasse und der Gesamtblattfläche? (iii) Ist die höhere Trockentoleranz der tetraploiden HAL durch den erhöhten Ploidiegrad verursacht? (iv) Zeigen die tetraploiden HAL unter Trockenstress früh physiologische Veränderungen im Kohlenhydratgehalt, dem relativen Blattwassergehalt und der stomatären Leitfähigkeit? (v) Gibt es genetische Modifikationen abgesehen von der Tetraploidie wie z.B. Duplikationen und Deletionen, die eventuell Einfluss auf das Trockensressverhalten haben könnten? In einem ersten Experiment wurden vier tetraploide HAL untersucht. Zwei HAL zeigten einen geringeren Wasserverbrauch und drei HAL eine spätere Verwelkung als der diploide Ausgangsklon. Außerdem entwickelten die tetraploiden HAL eine geringere Stomatadichte, größere Stomata und eine vergleichbare oder geringere Höhe, Biomasse und Gesamtblattfläche im Vergleich zum diploiden Ausgangsklon. Das zweite Experiment wurde mit vier diploiden und 16 weiteren tetraploiden HAL durchgeführt. Auch die diploiden Linien stammten aus Protoplastenfusions-experimenten. Die tetraploiden HAL wiesen im Mittel eine höhere Überlebensrate als die diploiden HAL auf, entwickelten aber durchdschnittlich ein geringeres Höhenwachstum. Unter Berücksichtigung der Höhe verwelkten 11 tetraploide, aber keine diploide HAL später als der diploide Ausgangsklon. In einem dritten Experiment wurden zwei Linien aus dem zweiten Experiment ausgewählt, die vergleichbares Höhenwachstum zeigten, aber später verwelkten als der diploide Ausgangklon. Es wurden physiologische Merkmale wie der Wasserverbrauch und der Verwelkungszeitpunkt der Blätter beobachtet und der relative Blattwassergehalt, die stomatäre Leitfähigkeit und der Kohlenhydratgehalt in einer Zeitreihe untersucht. Geringerer Wasserverbrauch im Vergleich zum diploiden Ausgangsklon konnte in beiden tetraploiden HAL gezeigt werden. Diese Beobachtung deckt sich mit dem höheren relativen Bodenwassergehalt der tetraploiden HAL im Vergleich zum diploiden Ausgangsklon. Insgesamt spricht das für geringeren Trockenstress in den tetraploiden HAL. Auf der anderen Seite sollte ein geringerer Wasserverbrauch auch eine geringere stomatäre Leitfähigkeit nach sich ziehen. Dies war in den tetraploiden HAL nicht durchgehend der Fall. Relativ zur Kontrolle konnten die tetraploiden Linien aber eine höhere stomatäre Leitfähigkeit bei Bodenwassergehalten aufrechterhalten, bei denen die diploide Ausgangslinie bereits ihre Stomata geschlossen hatte. Dies weist ebenfalls auf eine höhere Trockentoleranz der tetraploiden HAL hin. Genetische Modifikationen wie beispielsweise Duplikationen und Deletionen wurden mit Hilfe von “copy number variation”(“Kopienzahlvariation”)-Analysen an drei tetraploiden HAL und der diploiden Ausgangslinie durchgeführt. Die drei tetraploiden Linien zeigten vergleichbares Höhenwachstum, aber spätere Verwelkung als die diploide Ausgangslinie. Bei dieser Analyse konnten nur drei Segmente detektiert werden, die bei allen drei tetraploiden HAL im Vergleich zum diploiden Ausgangsklon verändert vorlagen. Die putativen Gene der detektierten Segmente wiesen keine Annotation auf. Eine der drei tetraploiden HAL zeigte eine hohe Anzahl von 90 Segmenten, die hier aber weder in dem diploiden Ausgangsklon noch in den beiden anderen tetraploiden Linien erhöht vorlagen. Diese Linie zeigte zwar eine höhere Trockentoleranz als der diploide Ausgangsklon, aber nicht gegenüber der anderen untersuchten tetraploiden HAL (Experiment 3). Beide tetraploiden HAL waren bezüglich des Wasserverbrauchs, des Verwelkungszeitpunktes und der stomatären Leitfähigkeit ähnlich. Dies lässt vermuten, dass die Trockentoleranz durch die Tetraploidie und nicht durch weitere genetische Modifikationen bedingt ist. Trotzdem ist eine weiterführende funktionelle Untersuchung der drei Segmente, die in allen tetraploiden HAL verändert auftraten, sinnvoll, da auch hier ein trockenrelevantes Gen verändert sein könnte. Um eine Relevanz der putativen Gene bezüglich Trockenheit zu testen, könnte zukünftig das Verhalten von Knock-out-Mutanten, denen die entsprechende Sequenz fehlt, unter Trockenstress untersucht werden. Abschließend ist zu bemerken, dass neben den hier untersuchten HAL mehrere hundert Fusionsprodukte in einem Verbundprojekt genetisch charakterisiert wurden. Die Heterofusionsfrequenz war äußerst gering und die Hybriden waren bereits in der in vitro Phase nicht überlebensfähig. Geringe Heterofusionsfrequenz wurde beteits in anderen Arten beobachtet (Cyclamen, Brassicaceae, Fabaceae, Poaceae, Solanaceae). Da in dieser Dissertation nur Homofusionslinien verwendet wurden, wurde die Vermehrbarkeit über Steckhölzer nicht getestet, sondern der Fokus auf das Trockenstressverhalten der tetraploiden Homofusionslinien gelegt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass veränderte morphologische Ausprägungen und eine höhere Trockentoleranz in den HAL mit erhöhten Ploidiegrad auftraten. Dies prädestiniert die tetraploiden Linien für Standorte, an denen Wasser als limitierender Faktor auftritt und hohe Ausfallraten durch Dürre erwartet werden.

Poplar (Populus) varieties that are planted in short rotation coppice are supposed to show high biomass production, the ability to propagate via stem cuttings but also drought tolerance because drought is a very important abiotic stressor that can negatively influence the plants' growth, vitality and productivity. For polyploid varieties of various species as crop species (Triticum), herbaceous species (Lonicera, Spathiphyllum, Nicotiana) as well as in tree species (Betula) higher tolerance towards stresses as, for example, drought was reported. Hybrid aspen Populus tremula (L.) x P. tremuloides (Michx.) that belong to the section Populus exhibit economically viable increase on soils where other tree species fail but miss the propagation via stem cuttings. Poplar species of the sections Tacamahaca and Aigeiros as, for example, P. nigra (L.) and P. trichocarpa (Torr. & Gray) x P. deltoides (Bartram ex Marsh) can be propagated via stem cuttings. To overcome crossing incompatibilties somatic hybridization was applied to P. tremula x P. tremuloides ('Münden 2') as one fusion partner and P. x canescens (INRA clone No. 717 1‑B4), P. nigra or P. trichocarpa x P. deltoides (B19) as the second fusion partner. According to the leaf morphology and microsatellite analysis the obtained fusion lines were assigned to the original clone P. tremula x P. tremuloides ('Münden 2') and showed a tetraploid set of chromosomes. In this dissertation, the main aim was to investigate the drought responses of the tetraploid hybrid aspen lines in comparison to the diploid original line P. tremula x P. tremuloides ('Münden 2'). Therefore, the following questions were addressed. (i) Do the tetraploid hybrid aspen lines perform better under drought than the diploid original line regarding e.g. the water consumption and the leaf vitality? (ii) Do the tetraploid hybrid aspen lines distinguish from the diploid original line in morphological traits as stomatal morphology, height, stem biomass and leaf area? (iii) Is the better drought performance in the tetraploid hybrid aspen lines due to the increased ploidy level, i.e. do the tetraploid hybrid aspen lines show better drought performance as higher survival rates, a delay in leaf wilting and higher relative leaf water content than the diploid “fusion” lines? (iv) Do the tetraploid hybrid aspen show early physiological changes in the relative leaf water content, the carbohydrate concentration and the stomatal conductance? (v) Are there any genetic modifications apart from the tetraploidy like duplications or deletions that might influence the drought performance? In a first experiment, four hybrid aspen lines were obtained. Two of them showed lower water consumption relative to height and three delayed leaf wilting compared to the diploid original line. Furthermore, the tetraploid hybrid aspen lines exhibited lower stomatal density, increased stomatal length, comparable or lower height, stem biomass and total leaf area and enhanced leaf mass per area when compared to the diploid original line. In a second experiment, four diploid “fusion” lines and 16 tetraploid fusion lines were screened for their drought performance. The tetraploid fusion lines showed enhanced survival rates over the diploid lines but exhibited decreased height. With regard to height 11 tetraploid fusion lines exhibited delayed total leaf wilting while none of the four diploid ”fusion” lines showed a delay in total leaf wilting with regard to the height when compared to the diploid original line. In a third experiment, two lines were selected from the second experiment that showed a delay in total leaf wilting with regard to height but comparable height growth to the diploid original line. Here, physiological traits like the water consumption and physiological responses like the relative leaf water content, the stomatal conductance and the carbohydrate content were investigated in a time course. A lower water consumption was observed in both tetraploid fusion lines in comparison to the diploid original line resulting in lower drought stress of the tetraploid fusion lines. The finding of lower water consumption in the tetraploid fusion lines was consistent with the increased soil moisture levels compared to the diploid original line. On the other hand, a lower water consumption would be in accordance with a lower stomatal conductance that was not observed in general for the tetraploid fusion lines. The tetraploid fusion lines were able to maintain the stomatal conductance relative to the control at relative soil moisture levels where the diploid original line had already closed their stomata. This finding supports a higher drought tolerance for the tetraploid fusion lines. Genetic modifications such as duplications and deletions were detected using copy number variation analysis. Whole genome sequencing was applied to three tetraploid fusion lines and the diploid original line. The three tetraploid fusion lines exhibited growth comparable to that of the diploid original line but also delayed total leaf wilting with regard to height. The copy number variation analysis revealed only three segments that were altered in all tetraploid fusion lines compared to the diploid line. Genes that were putatively encoded by these segments were not annotated. One tetraploid fusion line showed a high number of 90 segments that were increased in this line but neither in the diploid original nor in the other two sequenced tetraploid fusion lines. Although this line showed better drought performance than the diploid original line the water consumption, the leaf vitality and the stomatal conductance did not differ from the other tested tetraploid fusion line (experiment 3). This finding indicates that the drought response is rather due to the tetraploidy than to other genetic modifications. Nevertheless, a functional characterization of the three segments that were altered in all tetraploid fusion lines in comparison to the diploid line is useful and should be conducted in furture studies as drought-relevant genes might be affected. The relevance to drought of these putative genes could be tested by exposing knock-out mutants to dry conditions. Finally, it should be noted that the heterofusion frequency was very low with a few hybrids dying already in the in vitro stage. The fusion products originated from a joint project with several hundred fusion lines that were genetically characterized and only a few revealed as heterofusions. The heterofusion frequencies in other species (Cyclamen, Brassicaceae, Fabaceae, Poaceae, Solanaceae) is low as well. Since in this dissertation homofusion lines were investigated only, the propagation via stem cuttings was not investigated but I focused on drought responses of the tetraploid hybrid aspen lines. In conclusion, morphological changes and higher drought tolerance were observed in the hybrid aspen lines with increased ploidy level. This renders them to be planted on sites where water is a limiting factor and high failure of plants due to drought is expected.