Transfer of plant toxins from feed into milk – a challenge for future sustainable milk production Systems? | Transfer von Pflanzentoxinen aus Futtermitteln in die Milch – eine Herausforderung für zukünftige nachhaltige Milcherzeugungssysteme?

Climate change presents significant challenges for agriculture. The emission of greenhouse gases calls for a reassessment that influences the manufacture and processing of animal feed. Sustainable solutions, such as cultivating domestic grains as protein sources and adopting techniques like grazing livestock on grasslands and agroforestry, will gain importance. However, certain plants that are increasing in significance possess SPM. SPM serve various significant functions and have diverse effects on their surroundings. In addition to benefiting the plant and its environment, the primary motivation for producing these compounds is to provide a growth advantage and protection against herbivore predators, ensuring plant survival and reproduction. Nevertheless, ingestion of plants with SPM still occurs resulting in a possible risk to both animals and consumers if there is a transfer of SPM via feed into food of animal origin, especially into milk. For some SPM transfer into the milk is already investigated while for others there is still lack of data as summarized in Chapter I. Chapter I reviews the current literature on two secondary plant metabolites for which there is still a lack of data on their occurrence and possible transfer to milk, although there are indications that transfer may be possible. The QA are naturally occurring alkaloids in Fabaceae. Their best-known representative with a wide range of applications in animal nutrition, due to their beneficial protein content, are lupins, which are subdivided into sweet and bitter lupins depending on their QA content. QAs have multiple toxicological effects that result in a so-called anticholinergic syndrome causing among other coordination disorders, respiratory paralysis, tachyarrhythmia or cardiac arrest. Due to its chemical structure, a transfer into the milk of cows was suspected, but there are no data so far. Sapindaceae, a different botanical family, possesses recognized toxic properties. Within this family, certain SPM, namely HGA, MCPrG, and HGB, have led to significant toxic effects in humans, horses, and wild ruminants. Important representatives of the Sapindaceae are sycamore maple trees, which can be found in meadows and fields with contents on HGA, MCPrG and HGB in their seeds and seedlings. Initial studies suggest that these SPM may be transferred into the milk of mares or cows after ingestion of seeds or seedlings. Nonetheless, thorough research on the effects of these substances and their excretion in milk has not been conducted in dairy cows. Chapter II therefore explains the aims and hypothesis of the current thesis. The main part of this thesis consists of two published manuscripts summarized in Chapter III and IV. The primary objective was on increasing knowledge on the transfer QA into the milk of dairy cows as well as on the intake of maple toxins HGA, MCPrG and HGB and their subsequent Transfer into the milk of dairy cows. These efforts aimed to provide a more comprehensive assessment of the risks posed to both animals and consumers. Furthermore, a toxicokinetic model was derived to predict the feed to food transfer for QAs (published in Engel et al. 2022, Chapter III). The first study was conducted as a feeding trial in four Holstein-Friesian dairy cows. During the trial rapeseed meal was switched for either one or two kg of narrow-leafed lupins (L. angustifolius variety Boregine) for seven days as experimental periods with respective depuration periods. During these periods milk was sampled twice daily and analyzed on their respective QA content with an in-house validated novel LC/MS-MS method. Furthermore, milk ingredients were monitored regularly. Based on the data three-compartment toxicokinetic model was derived to predict feed to food transfer. The results reveal that an intake of 1’774 mg QA per cow per day had no effects on animal health. Thereby, the pattern of the used lupin was like those already reported for narrow-leafed lupins even though total QA content was in the upper range of reported QA contents. Already the administration of 1 kg of lupins resulted in a transfer of QA into milk with different transfer rates for all QAs. Administration of twice the number of lupins (2 kg) showed a significant dosedependent transfer of QA into milk. Calculation of individual transfer rates revealed transfer rates differing from 1.05% for isolupanine to 3.74% for multiflorine (Chapter III). With maximum QA contents in milk a preliminary risk assessment was made for high consumers (P95) indicating a potential risk for consumers in this scenario (Chapter III). Nevertheless, data on toxicokinetic and occurrence of QA in feed and food is lacking. Chapter IV aimed to investigate if there is an intake of sycamore seedlings by dairy cows while grazing and if so, if there is a transfer of their SPM into milk without the occurrence of clinical signs as known for other herbivores like horses after SPM ingestion. For that, five cows were subjected to an observational study over 4 days. Cows had access to a pasture with numerous seedlings growing between grass over a defined period. Additionally, they received a partial mixed ration in the barn ad libitum and concentrate feed suitable for their respective milk yields. Milk of individual cows was sampled twice daily as well as bulk tank milk of the whole herd (n=87) and analyzed on their content of HGA, MCPrG, HGB and their respective metabolites with a novel validated LC/MS-MS method. Experimental plots were placed on the pasture and seedlings were counted and photographed daily before cows were allowed to graze. Additionally, cows were observed by two independent observers and intake was captured if possible. Already on the first day, intake of sycamore maple seedlings was observed in dairy cows as a by-product of grazing. Noteworthily, only respective conjugated metabolites of HGA and MCPrG were measured in milk samples already on day 1 after grazing. Urine samples revealed MCPA-G contents above contents measured in diseased Peré David’s deer without the appearance of clinical symptoms. Statistical analysis revealed an increasing trend in MCPA-G contents in milk. There is still lack of data on toxicological effects of conjugated metabolites, but cows may be in general less susceptible to maple toxin intoxication. In conclusion, the present thesis highlights that a transfer of the investigated secondary plant metabolites into milk is possible. Current developments in relation to climate change call for a fundamental rethink of the agricultural sector. The significance of local forage and agroforestry methods is increasingly acknowledged. Further investigations are imperative to appraise the potential risk to consumers and to provide suggestions for farm management, feeding, and grazing practices. In the case of lupins, preliminary risk assessment revealed a possible Risk for certain consumer groups. However, the risk to the consumer can be further investigated and reduced by testing the lupins available on the market for their QA content, adapting the recommendations for use and carrying out additional toxicological studies. For SPM found in Sapindaceae including A. pseudoplatanus is remains uncertain whether the conjugated metabolites of HGA and MCPrG found in the milk of individual cows as well as bulk tank milk represent a potential risk to consumers. Nevertheless, both uptake by cows with apparently reduced susceptibility and the possibility of transfer were demonstrated which emphasizes the necessity to produce additional data. To promote sustainable agriculture, it is necessary to enhance the use of indigenous legumes like lupins and pasture farming. This progression necessitates a comprehensive analysis ofthe linked hazards. By establishing these potential threats, we can advance our knowledge of farming and agriculture and create positive environmental impacts that counteract climate change.

Der Klimawandel stellt die Landwirtschaft und Milchkuhhaltung vor große Herausforderungen. Der Ausstoß von Treibhausgasen erfordert einen Wandel, der sich auf die Herstellung und Verarbeitung von Futtermitteln auswirkt. Nachhaltige Lösungen, wie der Anbau einheimischer Körnerleguminosen als Eiweißquellen und die Anwendung von Techniken wie der Weidehaltung und der Agroforstwirtschaft, werden zukünftig an Bedeutung gewinnen. Einige Pflanzenfamilien, die in diesen Systemen eine wichtige Rolle spielen, besitzen jedoch sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe (SPM). Die SPM erfüllen verschiedene wichtige Funktionen und haben vielfältige Auswirkungen auf ihre Umgebung. Neben dem Nutzen für die Pflanze und ihrer Umwelt besteht der Hauptgrund für die Produktion dieser Verbindungen darin, einen Wachstumsvorteil und Schutz gegen Pflanzenfresser zu bieten und so das Überleben und die Fortpflanzung der Pflanze zu sichern. Dennoch werden SPM-haltige Pflanzen auch von Lebensmittel-liefernden Tieren aufgenommen, was ein mögliches Risiko für Tiere und Verbraucher darstellt, wenn SPM über Futtermittel in Lebensmittel tierischen Ursprungs, insbesondere in die Milch, gelangen. Für einige sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe ist der Übergang in die Milch bereits untersucht worden, während für andere noch keine Daten vorliegen, wie in Kapitel I zusammengefasst ist. Kapitel I gibt einen Überblick über die aktuelle Literatur zu zwei sekundären Pflanzeninhaltsstoffen, über deren Vorkommen und möglichen Transfer in die Milch noch keine Daten vorliegen. Es gibt jedoch Hinweise, dass ein Transfer möglich ist. Die QA sind natürlich vorkommende Alkaloide in Fabaceaen. Ihre bekanntesten Vertreter mit einem breiten Einsatzspektrum in der Tierernährung, aufgrund ihres vorteilhaften Proteingehaltes, sind Lupinen, die auf Grundlage ihres QA-Gehaltes in Süß- und Bitterlupinen eingeteilt werden. Die QA weisen multiple toxische Effekte auf, die in einem sogenannten anticholinergen Syndrom resultieren. Ausprägungen resultieren in koordinatorischer Dysfunktionen, respiratorischer Paralyse, Tachyarrythmien oder Herzstillständen. Aufgrund ihrer chemischen Struktur, wurde ein Transfer der QA in die Milch bereits vermutet, jedoch nicht nachgewiesen. Die Familie der Sapindaceae weist ebenfalls durch ihre Inhaltsstoffe toxische Merkmale auf. Innerhalb dieser Familie führen die sekundären Pflanzeninhaltsstoffe HGA, MCPrG und HGB zu signifikanten toxischen Effekten bei Menschen, Pferden und Wildwiederkäuern. Wichtige Vertreter der Sapindaceae sind Bergahornbäume (Acer pseudoplatanus), die häufig auf Wiesen und an Feldrändern aufzufinden sind. Sie enthalten HGA, MCPrG und HGB in ihren Samen und Keimlingen. Erste Studien zeigen, dass es zu einem Transfer der genannten sekundären Pflanzeninhaltsstoffe in die Milch von Stuten und Kühen kommen könnte. Bis jetzt wurden jedoch sowohl die Auswirkungen der Toxine auf die Tiergesundheit von Kühen als auch der mögliche Transfer in die Milch nicht hinreichend untersucht. In Kapitel II werden die Ziele und Hypothesen der vorliegenden Arbeit erläutert. Der Hauptteil dieser Arbeit besteht aus zwei veröffentlichten Manuskripten, die in Kapitel III und IV zusammengefasst sind. Das Hauptziel bestand darin, das Wissen über den Transfer von QA in die Milch von Milchkühen sowie über die Aufnahme der Ahorntoxine HGA, MCPrG und HGB und deren nachfolgenden Transfer in die Milch von Milchkühen zu erweitern. Diese Untersuchungen zielten darauf ab, die möglichen Risiken für Tiere und Verbraucher zu erforschen. Darüber hinaus wurde ein toxikokinetisches Modell zur Vorhersage des Transfers von QAs in die Milch abgeleitet (veröffentlicht in Engel et al. 2022, Kapitel III). Die erste Studie wurde als Fütterungsversuch an vier Holstein-Friesian Milchkühen durchgeführt. Während des Experiments wurde über jeweils sieben Tage mit entsprechenden Absetzphasen Rapsschrot gegen ein oder zwei Kilogramm schmalblättrige Lupinen (L. angustifolius, Sorte Boregine) ausgetauscht. Während dieser Zeiträume wurden zweimal täglich Milchproben entnommen und mit einer intern validierten neuen LC/MS-MS-Methode auf ihren jeweiligen QA-Gehalt analysiert. Darüber hinaus wurden die Inhaltsstoffe der Milch regelmäßig analysiert. Auf der Grundlage der Daten wurde ein toxikokinetisches Drei-Kompartiment-Modell abgeleitet, um den Übergang vom Futter in das Lebensmittel Milch vorherzusagen. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Aufnahme von 1‘774 mg QA pro Kuh und Tag keine Auswirkungen auf die Tiergesundheit hatte. Dabei war das QA-Muster der verwendeten Lupine ähnlich dem, welches bereits für schmalblättrige Lupinen berichtet wurde, während der Gesamt-QA-Gehalt eher im oberen Bereich der berichteten QA-Gehalte lag. Bereits die Verabreichung von 1 kg Lupinen führte zu einem Transfer von QA in die Milch mit unterschiedlichen Transferraten für alle QAs. Die Verabreichung der doppelten Menge an Lupinen (2 kg) zeigte einen signifikanten dosisabhängigen Transfer von QA in die Milch. Die Berechnung der einzelnen Transferraten ergab Transferraten, die zwischen 1,05% für Isolupanin und 3,74% für Multiflorin lagen (Kapitel III). Für die maximalen QA-Gehalten in der Milch wurde eine vorläufige Risikobewertung für Vielverzehrer (P95) vorgenommen, die auf ein potenzielles Risiko für Verbraucher in diesem Szenario hinweist. Dennoch fehlen Daten zur Toxikokinetik und zum Vorkommen von QA in Futter- und Lebensmitteln. In Kapitel IV sollte untersucht werden, ob Milchkühe auf der Weide Bergahornkeimlinge aufnehmen und ob es dabei zu einer Übertragung ihrer SPM in die Milch kommt, ohne dass klinische Symptome auftreten, wie sie bei anderen Pflanzenfressern wie Pferden nach der Aufnahme dieser SPM bekannt sind. Zu diesem Zweck wurden fünf Kühe einer Beobachtungsstudie über 4 Tage unterzogen. Die Kühe hatten über einen definierten Zeitraum Zugang zu einer Weide mit zahlreichen Bergahorn-Keimlingen, die zwischen dem Gras wuchsen. Zusätzlich erhielten sie im Stall eine partielle Mischration ad libitum und ein für ihre jeweilige Milchleistung geeignetes Kraftfutter. Die Milch der einzelnen Kühe wurde zweimal täglich, sowie die Tankmilch der gesamten Herde (n=87), beprobt und mit einer neuen validierten LC/MS-MS-Methode auf ihren Gehalt an HGA, MCPrG, HGB und ihren jeweiligen Metaboliten hin analysiert. Ergänzend wurden Versuchsflächen auf der Weide angelegt, und die darauf befindlichen Keimlinge täglich gezählt und fotografiert, bevor die Kühe Zugang zur Weide hatten. Zusätzlich wurden die Kühe von zwei unabhängigen Beobachtern beobachtet und die Aufnahme der Keimlinge nach Möglichkeit videographisch festgehalten. Bereits am ersten Tag wurde bei den Milchkühen die Aufnahme von Bergahornkeimlingen während des Weidegangs beobachtet. Anschließend konnten bereits am Tag 1 nach dem Weidegang die entsprechenden konjugierten Metaboliten von HGA und MCPrG in Milchproben gemessen werden. Urinproben wiesen MCPA-G Gehalte auf, die über den bei erkrankten Davidshirschen gemessenen Werten lagen, ohne dass klinische Symptome bei den Milchkühen auftraten. Die statistische Analyse ergab eine steigende Tendenz des MCPA-G Gehalts in der Milch. Es gibt noch keine Daten über die toxikologischen Auswirkungen konjugierter Metaboliten, aber Kühe könnten im Allgemeinen weniger anfällig für Vergiftungen durch diese Pflanzentoxine sein. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass ein Transfer der untersuchten sekundären Pflanzenstoffe in die Milch möglich ist. Die aktuellen Entwicklungen im Zusammenhang mit dem Klimawandel erfordern ein grundlegendes Umdenken in der Landwirtschaft. Lokale Futtermittel und agroforstwirtschaftliche Methoden werden in Zukunft immer mehr an Bedeutung gewinnen. Weitere Untersuchungen sind unerlässlich, um das potenzielle Risiko für die Verbraucher abzuschätzen und Vorschläge für Betriebsführung, Fütterung und Weidehaltung zu machen. Im Fall der Lupine ergab die vorläufige Risikobewertung ein mögliches Risiko für bestimmte Verbrauchergruppen. Das Risiko für den Verbraucher kann jedoch weiter untersucht und verringert werden, indem die auf dem Markt erhältlichen Lupinen auf ihren QA-Gehalt untersucht, die Verwendungsempfehlungen angepasst und zusätzliche toxikologische Studien durchgeführt werden. Bei SPM, die in Sapindaceae einschließlich A. pseudoplatanus vorkommen, ist nach wie vor ungewiss, ob die konjugierten Metaboliten von HGA und MCPrG, die in der Milch einzelner Kühe sowie in der Tankmilch gefunden wurden, ein potenzielles Risiko für die Verbraucher darstellen. Dennoch wurde sowohl die Aufnahme durch Kühe mit offensichtlich verminderter Suszeptibilität als auch die Möglichkeit einer Übertragung nachgewiesen, was die Notwendigkeit zusätzlicher Daten unterstreicht. Um eine nachhaltige Landwirtschaft zu fördern, müssen einheimische Leguminosen wie Lupinen und die Weide- und Forstwirtschaft verstärkt genutzt werden. Diese Entwicklung setzt eine umfassende Analyse der damit verbundenen Gefahren voraus. Durch die weitergehende Untersuchung dieser potenziellen Gefahren, kann das Wissen über die nachhaltige Landwirtschaft erweitert und eine positive Auswirkung auf die Umwelt im Hinblick auf den Klimawandel erzielt werden.