Molekulare Charakterisierung von ESBL-bildenden Escherichia coli-Isolaten aus Milchproben und Lebensmitteln pflanzlicher Herkunft | Molecular characterisation of ESBL-producing Escherichia coli isolates originating from mastitis milk and fresh vegetables

Antibiotikaresistente Bakterien wurden in den letzten Jahren immer häufiger in verschiedenen Reservoiren beschrieben. Dabei sind Produzenten von β-Laktamasen mit erweitertem Substratspektrum (sogenannte ESBLs) von großer Bedeutung. Escherichia coli spielt nicht nur als Darmbewohner bei Menschen und Tieren, sondern auch als Erreger intestinaler und extraintestinaler Erkrankungen, aber auch als Lebensmittelkontaminant eine wichtige Rolle. Ziel dieser Dissertation war es, (i) Informationen zum Vorkommen ESBL-bildender E. coli aus Milch- und Mastitis-Milchproben von Rindern, aber auch von Lebensmitteln pflanzlicher Herkunft zu erarbeiten und eine vergleichende molekulare Charakterisierung der entsprechenden Isolate durchzuführen, (ii) Informationen zur phänotypischen und genotypischen antimikrobiellen Resistenz dieser E. coli-Isolate zu erarbeiten und (iii) molekulare Untersuchungen zum Vorkommen und zur Übertragbarkeit von ESBL-Genen durchzuführen und Informationen zu ESBL-tragenden Plasmiden inklusive anderer auf diesen Plasmiden co-lokalisierten Resistenzgenen zu gewinnen. Dazu wurden von 2009 bis 2013 insgesamt 21548 Rinder aus 1070 verschiedenen Milchviehbetrieben beprobt und die entsprechenden Milchproben (n = 75382) auf das Vorhandensein von E. coli untersucht. Bei den nachgewiesenen 878 E. coli-Isolaten wurden 12 ESBL-Bildner identifiziert. Des Weiteren wurden bei insgesamt 245 Gemüse-Proben, die zwischen 2011 und 2013 von 43 Sprossen und 202 Blattsalaten genommen wurden, sieben ESBL-bildende E. coli in vier Sprossen-Proben (zwei Isolate stammten aus einer Probe) und zwei Blattsalat-Proben nachgewiesen. Der Nachweis der ESBL-Bildung erfolgte durch phänotypische Bestätigungstests. Die ESBL-Gene wurden durch spezifische PCR-Assays detektiert und durch Sequenzierung bestätigt. Das Vorhandensein von Plasmiden wurde durch Erstellung von Plasmid-Profilen bestätigt und die Übertragbarkeit der Plasmide durch Transformation und Konjugation getestet. Die ESBL-Gen-tragenden Plasmide der Transformanden und/oder Transkonjuganden wurden mittels PCR-basierter Replikon-Typisierung näher charakterisiert. Sowohl die E. coli-Isolate als auch ihre Transformanden und/oder Transkonjuganden wurden hinsichtlich ihrer antimikrobiellen Empfindlichkeit mittels Bouillon-Mikrodilution untersucht und die entsprechenden Resistenzgene über spezifische PCR-Assays identifiziert. Ausgewählte Plasmide wurden partiell sequenziert. Bei den 19 ESBL-Bildnern wurden folgende ESBL-Gene nachgewiesen: blaCTX-M-1 (n = 5), blaCTX-M-2 (n = 3), blaCTX-M-14 (n = 3), blaCTX-M-15 (n = 6), blaCTX-M-65 (n = 1) und blaCTX-M-125 (n = 1), davon acht in Kombination mit blaTEM-1. Bei den Isolaten von pflanzlichen Lebensmitteln wurde blaCTX-M-14 und blaCTX-M-15 je zweimal nachgewiesen, bei den Isolaten aus den Mastitis-Milchproben wurde blaCTX-M-15 am häufigsten nachgewiesen. Alle ESBL-Gene waren auf Plasmiden unterschiedlicher Größen (35 bis 245 kb) lokalisiert. Die Replikon-Typisierung ergab Plasmide unterschiedlicher Inkompatibilitätsgruppen: IncF, IncN, IncI1, IncK, IncFIA + IncFIB, IncFIB, IncHI2 sowie IncHI2 + IncP. Ein Plasmid war nicht typisierbar. Insgesamt 18 der 19 ESBL-Gen tragenden Plasmide erwiesen sich als konjugativ, wobei IncN- und IncI-1-Plasmide die höchsten Konjugationsraten (1,17 x 10-2 bis 5,5 x 10-4) zeigten. Die ESBL-bildenden E. coli-Isolate wurden mittels PCR-basierter Bestimmung der phylogenetischen Gruppe, Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) und Makrorestriktionsanalysen typisiert. Bei den phylogenetischen Gruppen dominierte die Gruppe A (n = 10), gefolgt von B1 und D (jeweils n = 4) sowie B2 (n = 1). Mittels MLST wurden viele verschiedene Sequenztypen (ST) identifiziert. Lediglich ST10 konnte bei mehreren Isolaten der Mastitis-Milchproben und Sprossenproben nachgewiesen werden. Vereinzelt wurden auch ST117 und ST410, welche häufiger bei Menschen und Lebensmittel beschrieben wurden, detektiert. Die Makrorestriktionsanalyse zeigte bei zwei Isolaten aus Mastitis-Milchproben verschiedener Herden nicht unterscheidbare Muster (bei ähnlichen Eigenschaften der Isolate/Plasmide) und bei zwei weiteren Mastitis-Milchisolaten unterschiedlicher Herden sehr ähnliche Muster (bei gleichen Eigenschaften der Isolate/Plasmide). Zwei sehr ähnliche Isolate einer Mastitis-Milchprobe wiesen unterschiedliche Muster auf. Die restlichen Isolate, inklusive der von den Salaten und Sprossen, wiesen allesamt verschiedene Makrorestriktionsmuster auf. Von den 19 ESBL-bildenden E. coli-Isolaten zeigten 15 einen Multiresistenz-Phänotyp. Elf der ESBL-Gen-tragenden Plasmide wiesen co-lokalisierte Resistenzen auf, neun davon wurden als Multiresistenz-Plasmide klassifiziert. Die auf den ESBL-Gen-tragenden Plasmiden identifizierten Resistenzgene vermittelten (i) Resistenzen gegenüber Gentamicin, Kanamycin, Streptomycin, Chloramphenicol/Florfenicol, Fosfomycin, Tetracyclinen, Sulfonamiden oder Trimethoprim oder (ii) reduzierte Empfindlichkeit gegenüber (Fluor)Chinolonen. Zudem trugen sieben Plasmide Integrons der Klasse 1 mit den Genkassetten-Arrays dfrA12-orfF-aadA2, dfrA1-aadA1 oder dfrA17-aadA5. Die partielle Sequenzierung zweier Plasmide (pCTX48 und pCTX64) zeigte, dass die vorhandenen co-lokalisierten Resistenzgene zum Teil in der Nähe der ESBL-Gene zu finden sind. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass ESBL-Gene bei E. coli-Isolaten von Mastitis-Milchproben und Lebensmitteln pflanzlicher Herkunft zwar selten vorkommen, wenn dann aber meistens auf konjugativen Plasmiden unterschiedlicher Größen und Inkompatibilitätsgruppen, die zudem häufig co-lokalisierte Resistenzgene tragen. Dies leistet einer wechselseitigen Co-Selektion und der Persistenz der entsprechenden Resistenzgene Vorschub. Der Nachweis ESBL-bildender E. coli zeigt, dass die Lebensmittelkette, insbesondere Rohmilch und roh zu verzehrende Salate und Sprossen, ein mögliches Reservoir für die Verbreitung ESBL-bildender, multiresistenter E. coli und ihrer Resistenzgene darstellen kann.

Antimicrobial-resistant bacteria have been increasingly reported in different reservoirs during the last years. Among them, producers of extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) are of particular importance. Escherichia coli is a commensal bacterium in the intestinal tract of humans and animals but also plays an important role not only as causative agent of intestinal and extraintestinal infections, but also as a contaminant of food intended for human consumption. The aims of this doctoral thesis were (i) to compile information on the occurrence of ESBL-producing E. coli isolated from mastitis milk samples and raw vegetables and to submit the respective isolates to a comparative molecular characterisation, (ii) to determine the genotypic and phenotypic resistance profiles of the E. coli isolates, and (iii) to gain insight into the presence, transferability and plasmid location of the ESBL genes, but also to investigate the corresponding plasmids for the presence of other co-located resistance genes with regard to the co-selection of ESBL genes. For this purpose, 21,548 cattle from 1,070 different dairy farms were sampled during 2009 – 2013 and the milk samples taken (n = 51,263) were examined for the presence of E. coli. Among the 878 E. coli isolates obtained, 12 were identified as ESBL-producers. Furthermore, among 245 vegetable samples, obtained between 2011 and 2013 and comprising 43 samples from sprouts and 202 from leaf lettuces, seven ESBL-producing E. coli were detected in four sprout samples (two isolates were from the same sample) and two leaf lettuce samples. ESBL-production was verified via phenotypic confirmatory tests. The ESBL genes were detected by specific PCR assays and confirmed by sequencing. The presence of plasmids was examined by plasmid profiling and the transferability of plasmids was tested by transformation and conjugation. The ESBL gene-carrying plasmids of the transformants and transconjugants were characterised using PCR-based replicon typing.Furthermore, the E. coli isolates and their transformants and/or transconjugants, were investigated for their antimicrobial susceptibility via broth microdilution and the corresponding resistance genes were identified using specific PCR-assays. Selected plasmids were in part sequenced. Within the 19 ESBL producers, the following ESBL genes were detected: blaCTX-M-1 (n = 5), blaCTX-M-2 (n = 3), blaCTX-M-14 (n = 3), blaCTX-M-15 (n = 6), blaCTX-M-65 (n = 1), and blaCTX-M-125 (n = 1), eight of these genes in combination with blaTEM-1. Among the isolates from salads and sprouts, blaCTX-M-14 and blaCTX-M-14 were each detected twice, whereas blaCTX-M-15 was most frequently detected among the isolates from mastitis milk samples. All ESBL genes were located on plasmids of different sizes (35 to 245 kb). Replicon typing resulted in the identification of plasmids of various incompatibility groups, including IncF, IncN, IncI1, IncK, IncFIA + IncFIB, IncFIB, IncHI2, and IncHI2 + IncP. One plasmid was not typeable. Eighteen of the 19 plasmids proved to be conjugative with IncF and IncI1 plasmids showing the highest conjugation efficiency (1,17 x 10-2 to 5,5 x 10-4). The ESBL-producing E. coli isolates were investigated in more detail by PCR-based determination of the phylogenetic groups, multilocus sequence typing (MLST), and macrorestriction analysis. Group A (n = 10) was the most frequently found phylogenetic group, followed by B1 and D (n = 4, each) and B2 (n = 1). MLST identified many different sequence types (STs). Solely ST10 was detected in several isolates obtained from mastitis milk and sprout samples. Occasionally, ST117 and ST410, which were described more frequently in humans and food, were also detected. Macrorestriction analysis revealed indistinguishable patterns of two isolates from mastitis milk samples of different herds (with similar properties of the respective isolates/plasmids), and very similar patterns of another two isolates from mastitis milk samples of different herds (with the same properties of the isolates/plasmids). Two very similar isolates from the same mastitis milk sample showed different macrorestriction patterns. The remaining isolates, including those from salads and sprouts, all exhibited different macrorestriction patterns. Of the 19 ESBL-producing E. coli isolates, 15 showed a multiresistance phenotype. Eleven of the ESBL gene-carrying plasmids showed co-localised resistances, with nine of them being classified as multiresistance plasmids. The resistance genes identified on these plasmids conferred (i) resistance to gentamicin, kanamycin, streptomycin, chloramphenicol/florfenicol, fosfomycin, tetracyclines, sulfonamides, or trimethoprim or (ii) reduced susceptibility to (fluoro)quinolones. In addition, seven plasmids carried class 1 integrons with the gene cassettes dfrA12-orfF-aadA2, dfrA1-aadA1 or dfrA17-aadA5. Partial sequence analysis of two plasmids (pCTX48 and pCTX64) revealed that some of the colocated resistance genes were present in the close vicinity of the ESBL genes. The results of this thesis showed that ESBL genes occur rarely among E. coli isolates from mastitis milk samples and foods of plant origin. However, if so, the ESBL genes are commonly located on conjugative plasmids of different sizes and incompatibility groups, which often harbor additional resistance genes. This latter aspect is of importance when considering aspects of co-selection and persistence of antimicrobial resistance genes. The identification of ESBL-producing E. coli from the aforementioned sources, however, suggests that the food chain, in particular raw milk and salads/sprouts, may represent a reservoir for the spread of ESBL-producing multiresistant E. coli isolates and their mobile resistance genes.