Einfluss der Korrosion von biodegradablen Metallen auf die Fremdkörperantwort | The Influence of corrosion from biodegradable metals on the foreign body response

1\. Einleitung 1 2\. Literaturteil 3 2.1 Die Fremdkörperreaktion 3 2.1.1 Besonderheiten der Fremdkörperantwort bei der Ratte 5 2.1.2 Einfluss der Oberflächenbeschaffenheit von Biomaterialien auf die FBR 6 2.1.2.1 Einfluss von Oberflächeneigenschaften auf Makrophagen 6 2.2 Physiologie zellulärer Eigenschaften der Ratte und deren Einfluss auf die FBR 7 2.2.1 Merkmale der Lymphozyten 7 2.2.2 Merkmale der Makrophagen 8 2.2.3 Merkmale der Monozyten 10 2.2.4 Merkmale der Granulozyten 11 2.2.5 Merkmale der Mastzellen 12 2.2.6 Merkmale der Natürlichen Killerzellen 12 2.2.7 Merkmale der Dendritischen Zellen 12 2.3 Eigenschaften der Implantationsmaterialien 13 2.3.1 Magnesium als Biomaterial 13 2.3.1.1 Biokompatibilität 14 2.3.1.2 Zytotoxizität 15 2.3.2 Gadolinium 16 2.3.2.1 Biokompatibilität 16 2.3.2.2 Zytotoxizität 17 2.4 Die Durchflusszytometrie 17 3 Material 20 3.1 Laborgeräte 20 3.2 Verbrauchsmaterialien 20 3.3 Reagenzien 20 3.4 Antikörper 20 3.5 Isotypen 21 3.6 Hergestellte Lösungen 22 3.7 Software und Datenbanken 23 4 Methoden 24 4.1 Etablierung 24 4.1.1 Titration der Antikörper 24 4.1.2 Kompensation 24 4.1.3 FMO (Fluoreszenz Minus One) 25 4.1.4 Isotypkontrollen 27 4.2 Versuchsdurchführung 28 4.2.1 Auswahl und Bezug der Tiere 28 4.2.2 Einteilung der Gruppen 28 4.2.3 Beschaffenheit der Implantate 29 4.2.4 Operationsmethodik 29 4.2.5 Finalisierung 29 4.3 Probenaufarbeitung 30 4.3.1 Aufarbeitung von Vollblut 30 4.3.1.1 Herstellung der FACS-Färbung 30 4.3.1.2 Gatingstrategie der Blutproben 30 4.3.2 Aufarbeitung der Kapsel 31 4.3.2.1 Gatingstrategie der Kapselproben 31 4.3.2.2 Auswertung der durchflusszytometrischen Ergebnisse 33 4.3.3 Zellsortierung und Zytozentrifugation zur Identifikation der Zellpopulationen 33 4.3.4 Ablösen der Korrosionsprodukte zur Bestimmung der Korrosionsrate 34 4.3.5 In vitro Studien zur Bestimmung der Korrosionsrate im Bioreaktor 34 4.3.6 Rauigkeitsmessungen der Implantate durch mechanische Profilometrie 35 4.3.7 Oberflächenanalyse mittels Raster-Elektronen- Mikroskopie (REM) 35 4.3.8 quantitative Real-Time PCR 36 4.3.8.1 Isolierung der RNA 36 4.3.8.2 Reverse Transkription 36 4.3.8.3 RT - PCR 37 4.3.8.4 Relative Quantifizierung 37 4.3.9 Statistische Auswertung 38 4.4 Die Arbeit anderer Doktoranden an der Forschungsreihe 39 5 Ergebnisse 40 5.1 Ergebnisse der Durchflusszytometrie 40 5.1.1 Blut-Leukozyten 40 5.1.2 Kapsel-Leukozyten 45 5.1.2.1 Kapsel subkutan 45 5.1.2.2 Kapsel intramuskulär 52 5.2 Zellsortierung & Zytospin 57 5.3 Bestimmung der Korrosionsrate 61 5.3.1 Bestimmung der Korrosionsrate in vivo 61 5.3.2 Bestimmung der Korrosionsrate in vitro 61 6.2.3 Vergleichbarkeit der In-Vivo- und In-Vitro-Korrosionsdaten 62 6.3 Ergebnisse der Profilometrie 63 6.4 Rasterelektronenmikroskopische Ergebnisse 64 6.4.1 Vor der Implantation 64 6.4.1.1 MgGd10 64 6.4.1.2 MgGd5 64 6.4.1.3 MgFe 65 6.4.2 Nach der Implantation 65 6.4.2.1 MgGd10 65 6.4.2.2 MgGd5 66 6.4.2.3 MgFe 67 6.5 Quantitative RT-PCR 69 7 Diskussion 70 7.1 Akzeptanz und Integration des Implantates während der FBR 70 7.2 Das Paradigma von M1- und M2- Makrophagen 71 7.3 Mikroskopische Eigenschaften der Makrophagensubpopulationen 73 7.4 Einfluss der T-Zellen auf die FBR 73 7.5 Die Durchflusszytometrie als Methode zur Charakterisierung der FBR 74 7.6 Die Perfusionsrate als maßgebliche Beeinflussung der FBR 74 7.7 Ausschluss einer bakteriellen Kontamination in Kapselproben 75 7.8 Diskussion des Einflusses von Oberflächeneigenschaften und der Korrosionsgeschwindigkeit der eingesetzten Materialien auf die FBR 75 7.9 Abschließende Betrachtung 76 8 Zusammenfassung 78 9 Summary 79 10 Literaturverzeichnis 80 11 Anhang 92 12 Publikationen 106 13 Danksagung 107 14 Selbstständigkeitserklärung 108

Magnesiumlegierungen spielen aufgrund ihrer mechanischen Eigenschaften eine bedeutende Rolle im wachsenden Feld von Biomaterialien. Die Beteiligung von Magnesium in mannigfaltige biochemische Prozesse und als natürlicher Bestandteil des Körpers reflektiert das vielversprechende Potential als Implantatmaterial. Durch die Implantation eines Medizinproduktes wird eine Fremdkörperreaktion ausgelöst, die die Endphase der Wundheilung darstellt und vorrangig durch Makrophagen und Fremdkörperriesenzellen geprägt wird. Es ist bekannt, dass der Ablauf und die Intensität der FBR als direkte Antwort des Organismus auf biodegradable Werkstoffe im direkten Zusammenhang mit deren Biokompatibilität stehen. Die direkte Beeinflussung der beteiligten Zellpopulationen im Sinne einer bioinerten Integration der Materialien und einer nur mäßig ablaufenden FBR ist das Ziel für den medizinischen Einsatz um eine adäquate Stabilisierung eines Defektes zu ermöglichen und eine Implantatabstoßung zu verhindern. Kenntnisse über die quantitative Beteiligung der Zellpopulationen von T-Zellen, Granulozyten und Makrophagen an der FBR auf ausgewählte, biodegradierbare Magnesiumlegierungen: MgGd10, MgGd5 und MgFe in Abhängigkeit von der Zeit von 1 bis 28 Tagen wurden in dieser Studie an zwei unterschiedlichen Lokalisationen (subkutan, intramuskulär) über ein durchflusszytometrisches Panel im Rattenmodell erworben. Im Blut konnten keine systemisch nachweisbaren Veränderungen als Reaktion auf die FBR festgestellt werden. Unabhängig vom Implantationsort wurde ein direkter Zusammenhang zwischen der Korrosionsrate der eingesetzten Materialien und der Anzahl der lebenden Leukozyten ermittelt: mit steigender Korrosionsrate wächst die Anzahl der lebenden Leukozyten in der Kapsel um das Implantat. Ein zeitlich charakteristischer Verlauf der FBR auf Magnesiumimplantate, unabhängig von der Lokalisation, entsprechend einer perakuten, akuten und chronischen Gliederung wurde beobachtet. Daten über den spezifischen zellulären Verlauf der FBR auf Magnesiumlegierungen standen zuvor nicht zur Verfügung. Wir konnten demnach nicht nur quantitative Aussagen über den Ablauf der FBR treffen, sondern auch ein standardisiertes Verfahren entwickeln, welches im wachsenden Feld der Biomaterialien die Möglichkeit bietet den zeitlich-zellulären Verlauf der FBR aufzuzeichnen. Durch die Weiterentwicklung des Verfahrens könnten zudem wichtige funktionelle Aussagen getroffen werden, die derzeit nur hypothetischen Charakter besitzen. Ein weiterer wichtiger Kernpunkt dieser Arbeit ist die vergleichende Betrachtung der zellulären FBR im Zusammenhang mit den Oberflächeneigenschaften und dem Korrosionsverhalten der eingesetzten Materialien.

Due to their mechanical properties, magnesium alloys play a significant role in the growing field of biomaterials. Being a natural component of the body, the involvement of magnesium in various biochemical processes reflects the promising potential as a suitable implant material. The implantation of a medical device initiates a foreign body reaction, which is the final phase of wound healing and is predominantly characterized by macrophages and foreign body giant cells. It is known that the process and the intensity of the FBR as a direct response of the organism are directly related to the biocompatibility of biodegradable materials. For medical use the aim is direct influencing of the participating cell population for an appropriate integration of the materials. To enable an adequate stabilization of an injury and to prevent implant rejection a moderate foreign body reaction is the goal of biological responses. Knowledge about quantitative involvement of T cell, granulocyte and macrophage populations on the selected biodegradable magnesium alloys MgGd10, MgGd5 and MgFe, depending on the time of 1 to 28 days, in this study was acquired in two different locations subcutaneous and intramuscularly via a flow cytometry rat model panel. Systemic changes in blood could not be detected in response to the foreign body reaction. Regardless of the location of the implant, a direct relationship between the corrosion rate and the number of living leukocytes could be determined. As the corrosive rate increases, the number of living leukocytes in the capsule increases around the implant. A characteristic progression of the foreign body reaction to magnesium implants was observed regardless of the localization according to a peracute, acute and chronic structuring. Data on the specific pathway of the foreign body reaction to magnesium alloys were not available before. Thus, we could not only make statements about the behavior of the FBR but could also develop a standardized procedure which allows to note the chronological cellular process of the FBR. Further development of our panel could be an opportunity to make statements about functional relationships between cellular responses to biomaterials, which currently only have a hypothetical character. An important focus of this work is the comparative consideration of the cellular FBR in connection with the surface properties and the corrosion behavior of the used materials.