Quantitative Expressionsanalysen von CLCA-Homologen bei Mausmodellen der Zystischen Fibrose | Quantitative Expression Studies of CLCA-Homologues in Murine Models of Cystic Fibrosis

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Die CLCA-Genfamilie mutmaßlicher Ca2+-aktivierter Cl--Kanäle zählt zu den eventuellen modulatorischen Genen, die maßgeblich den Phänotyp der Zystischen Fibrose beeinflussen. Aufgrund der bisherigen Erkenntnisse der Zystischen- Fibrose-Forschung weisen zahlreiche Beispiele auf eine zentrale Bedeutung von modifizierenden Genen bei der Pathogenese der Erkrankung hin, die außerhalb des cftr-Locus gelegen sind. Anhand elektrophysiologischer Daten, mRNA- Expressionsanalysen und kürzlich veröffentlichter Allelvariationsstudien mit Mikrosatellitenmarkern ergeben sich zunehmend Hinweise, dass ein Teil dieser modifi-zierenden Einflüsse von Mitgliedern der CLCA-Genmilie, möglicherweise durch die Vermittlung einer alternativen, Ca2+-aktivierter Cl--Leitfähigkeit, mediiert werden könnte. In der vorliegenden Arbeit wurde die mRNA- Expressionsrate der murinen mCLCA1- , mCLCA2- , mCLCA3- und mCLCA4-Homologen mittels quantitativer real-time RT-PCR im Dünndarm von CF- (cftrTgH(neoim)1Hgu, cftrtm1Cam) und WT-BALB/cJ-, -C57BL/6J-, -DBA/2J- und -NMRI-Mäusen quantifiziert. Dabei wurden große Unterschiede der mRNA- Expressions-raten aller vier CLCA-Homologen zwischen den vier WT-Mausstämmen detektiert. Die mRNA-Expressionsraten von mCLCA1 und mCLCA4 waren bei CF- und WT-Mausgruppen ähnlich hoch. Dagegen war die mCLCA3-mRNA-Expressionsrate bei allen CF-Mausmo-dellen deutlich erhöht. Die immunhistochemische Detektion von mCLCA3-Protein und die Identifizierung von Becherzellen mittels der PAS- Reaktion zeigten ähnlich starke Zunahmen an mCLCA3-positiven Becherzellen bei den CF-Mausmodellen. Deswegen kann mit großer Wahrscheinlichkeit angenommen werden, dass die erhöhte mCLCA3-mRNA-Expression eine Folge der Becherzellhyperplasie war und nicht auf Regulationsmechanismen auf dem Transkriptionslevel beruhten. Die beobachteten Zunahmen an mCLCA2-mRNA- Kopienzah-len bei den CF-Mausmodellen dagegen scheinen tatsächlich auf einer hochregulierten Transskription zu beruhen. So waren Veränderungen der mRNA- Kopienzahlen nicht mit veränderten Zellkinetiken des Darmepithels assoziiert, wie mit Hilfe einer immunhistochemi- schen Detektion des phospho- Histon3-Proteins und des aktivierte-Caspase3-Proteins bestätigt wurde. Insgesamt kann aufgrund dieser Ergebnisse geschlossen werden, dass mCLCA2 und mCLCA3 potentiell durch ihre verstärkte Expression als modifizierende Gene des Phänotyps von CF-Mausmodellen im Darm in Frage kommen. Mit Hilfe der Sequenzierung des offenen Leserahmens von mCLCA3 konnte keine Allel-variation im mclca3-Gen, zumindest nicht in der kodierenden Region und bei diesen vier Mausstämmen, festgestellt werden, die mit diesen Expressionsunterschieden in Zusam-menhang zu bringen gewesen wären.

Members of the family of calcium-activated chloride channels (CLCA) have been implicated as modulators of the phenotype in cystic fibrosis (CF). Results of several different studies have shown that CF disease severity is modulated by other genetic factors than CFTR. Electrophysiological, mRNA-expression and allelic variation studies seem to imply that, at least in part, members of the CLCA gene family could be responsible for this modulation by mediating an alternative calcium-activated chloride conductance. Here, the expression levels of the murine mCLCA1, mCLCA2, mCLCA3 and mCLCA4 were quantified by real-time RT-PCR in the small intestines of CF (cftrTgH(neoim)1Hgu, cftrtm1Cam) and wild type BALB/cJ, C57BL/6J, DBA/2J und NMRI mice. Markedly different expression levels of all four CLCA-homologs were observed between the different wild type strains. Expression of mCLCA1 and mCLCA4 was similar in CF versus wild type mice. In contrast, mCLCA3 mRNA copy numbers were increased up to three-fold in all CF models. Immunohistochemichal detection of mCLCA3- and PAS-positive cells on consecutive tissue sections identified a similar increase in mCLCA3-expressing goblet cells, suggesting that elevated mRNA copy numbers of mCLCA3 are due to goblet cell hyperplasia rather than transcriptional regulatory events. Increased mCLCA2 mRNA copy numbers, however, were considered more likely to be due to transcriptional upregulation. Changes in mRNA copy numbers were not associated with altered cell kinetics as determined by immunohistochemistry using antibodies to phospho-histone 3 and activated caspase 3. The results suggest that both mCLCA2 and mCLCA3 may act as modifiers of the intestinal phenotype in CF. Sequence analysis of the open reading frame of mCLCA3 failed to identify allelic variations in the coding region between the four different mouse strains and thus variations in coding sequences were not associated with differences in mCLCA-expression levels.