Torulaspora delbrueckii: un modelo para el estudio del estrés por NaCl en levadura de panaderia.

RESUMEN Los hábitos alimenticios del hombre han variado en estos últimos años, aumentando la demanda de productos congelados de panadería y bollería por lo que se requieren levaduras con gran resistencia a diferentes tipos de estrés. En la masa panaria, la presencia de NaCl provoca por una parte un estrés osmótico debido a la pérdida masiva de agua de la célula y por otra parte un estrés iónico debido a las altas concentraciones de iones Na+ y Cl- en el citoplasma, lo que tiene efectos dañinos para la levadura. Torulaspora delbrueckii es una levadura capaz de fermentar una masa panaria y más resistente a estrés que la habitualmente utilizada en la industria, Saccharomyces cerevisiae. A pesar de cumplir con las demandas actuales de la industria, los productores son muy reacios a la introducción de un nuevo microorganismo, ya que esto significaría tener que modificar sus ya bien establecidos procesos de producción. Por ello, hemos utilizado a la levadura T. delbrueckii en este trabajo, como organismo modelo de estudio del estrés por NaCl en levadura de panadería. Nos encontramos ante un microorganismo muy poco estudiado, sobretodo a nivel molecular, por lo que hemos desarrollado herramientas para su utilización en el laboratorio. Hemos conseguido aislar los genes HIS3 y LEU2, que son habitualmente utilizados como marcadores auxotróficos y además hemos conseguido una cepa de T. delbrueckii auxótrofa para el gen LEU2. Gracias a la secuenciación de estos genes y de sus regiones flanqueantes en varias levaduras, hemos podido añadir más información para esclarecer las relaciones filogenéticas entre el grupo de levaduras Saccharomyces sensu stricto y sensu lato. Centrándonos en T. delbrueckii como modelo de reistencia a estrés salino, se han aislado genes cuya sobreexpresión confiere resistencia a NaCl en S. cerevisiae. Así hemos identificado una pauta de lectura abierta que codifica una proteína, con una alta homología a Ena1, Ena2 y Ena5 de S. cerevisiae. El aislamiento de TdENA1 en este rastreo, indicó que la estrategia empleada era correcta ya que este gen codifica la principal ATPasa tipo P implicadas en el bombeo de iones Na+ al exterior de la célula cuya función determina resistencia a estrés iónico. La sobreexpresión de TdDED1 confirió resistencia a sal en Saccharomyces. Ded1p es una RNA helicasa de la denominada familia DEAD-box. Hemos comprobado que este gen se induce tanto en condiciones de estrés salino como en condiciones de baja temperatura, estableciéndose su implicación en resistencia a estrés. Por último la sobreexpresión del extremo 3´ de un gen homólogo a SIP1 de S. cerevisiae, aumentó la tolerancia de la cepa salvaje a NaCl. Sip1p junto a Sip2p y Gal83p son las subunidades  de la proteína quinasa Snf1p que juega un papel fundamental en la regulación de genes reprimidos por glucosa. Análisis del fenotipo de un mutante nulo en SNF1 en medios con sal, indicó que esta proteína quinasa tiene un papel funcional como represor de genes que se inducen en estas condiciones de estrés, en concreto genes cuya expresión está regulada por la ruta de la calcineurina. Profundizando en esta línea de trabajo, nuestros resultados nos han permitido establecer una regulación, directa o indirecta de la ruta de la calcineurina por Snf1p en condiciones de normales de crecimiento, es decir en ausencia de estrés salino. ____________________________________________________________________________________________________ SUMMARY Saccharomyces cerevisiae has probably been the first microorganism exploited by men. In baker industry, human food habits have changed in the past few years, increasing frozen products demand. This is why more resistant yeast is required by producers. In our lab, we have focused our attention on improving osmotolerance in baker yeast. The presence of NaCl reduces water activity of the dough and there are also further effects due to the toxicity of sodium and chloride ions. Thus, this stressful environment causes loss of fermentation capacity, leading to longer proofing times and reduced product volume. Torulaspora delbrueckii, a non-conventional yeast, is often isolated from home-made bread-dough. Some strains display a great baking ability and unlike Saccharomyces, they are able to cope with several stresses, including osmotic stress. This trait made this organism a potential model to understand the mechanisms underlying stress resistance in bakers yeast. Otherwise, very little is known about this yeast, including the tools for its manipulation. In the present work we have isolated and characterised the HIS3 and LEU2 gene from T. delbrueckii and the adjacent genes. Analysis of gene order and transcriptional orientation of these regions helped in the study of the phylogenetic relationships among yeasts. We have also isolated T. delbrueckii genes which conferred salt resistance when overexpressed in S. cerevisiae. These genes are the homologous of the RNA helicase DED1, the ATPase ENA1, and the C-terminal part of Sip1p. Finally, we have studied the implications of Snf1p in the salt stress response. Our results suggested that this protein kinase play a role as a repressor of genes induced by saline stress, concretely genes whose expression is regulated by the calcineurin pathway. Snf1p, directly or indirectly control the activation of the calcineurin pathway under non-stress conditions.