Bioaccesibilidad y efectos biológicos de esteroles vegetales y sus óxidos en una bebida láctea enriquecida en esteroles vegetales

El colesterol ha sido asociado directamente como factor clave en las enfermedades de riesgo cardiovascular. El efecto de los esteroles vegetales (EV) en la reducción del colesterol (10-15%) es ampliamente conocido, si bien, la ingesta necesaria (2-3 g/día) para este efecto debe ser superior a la dietética. Por ello, los EV se utilizan en el enriquecimiento de alimentos, siendo la margarina el primer alimento enriquecido. Este tipo de alimentos es contrario a las recomendaciones dietéticas actuales orientadas hacia un menor consumo de grasa, por ello actualmente se han enriquecido otros alimentos con mejor perfil nutricional (leche, zumo con leche, yogur…). Los EV pueden oxidarse dando lugar a productos de oxidación (POPs). Los estudios en los que se evalúan los efectos biológicos relativos a los POPs son escasos y, en muchos casos, contradictorios. Debido a la similitud estructural, se atribuyen los efectos causados por los productos de oxidación del colesterol (COPs) a los POPs, los cuales se han relacionado con una serie de patologías relacionadas con la modulación del metabolismo lipídico y la disfunción celular. El objetivo de la presente tesis doctoral es el estudio de los EV y POPs en bebidas a base de zumo de frutas y/o leche enriquecidas en EV, mediante la selección de un ingrediente fuente de EV, el estudio de estabilidad de los EV y la bioaccesibilidad (BA) de los EV y POPs presentes en dichas bebidas utilizadas en el marco de un estudio de intervención clínica en humanos. Paralelamente se han evaluado los efectos biológicos de 7-cetoderivados de estigmasterol y colesterol en cultivos celulares del epitelio intestinal (Caco-2) como primera barrera fisiológica para la absorción de estos compuestos. El estudio de los efectos biológicos incluye la determinación de la citotoxicidad causada por los 7-cetoesteroles (evaluando la actividad lisosomal, la funcionalidad e integridad mitocondrial y el contenido de ácidos nucleicos), el potencial inflamatorio (mediante la expresión relativa (ARNm) de biomarcadores (NFκB, TNFα, receptor IL-1β) la cuantificación de citoquinas (TNFα, IL-1β, IL-8, IL-10) y su efecto sobre la modulación del metabolismo del colesterol (monitorización de transportadores (NPC1L1, ABCG5/8) y enzimas (HMGCoA, ACAT)). Se optimiza (energías de colisión) la identificación de POPs por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) para la posterior detección de estos compuestos en las bebidas utilizadas en la presente tesis doctoral. De los dos ingredientes ensayados (tall oil y aceites vegetales), se selecciona el tall oil. Este ingrediente permite una mejor cuantificación (disminución de la formación de emulsiones y mejor reproducibilidad en ambas matrices (zumo y zumo con leche)) de los EV en las bebidas a las que se ha adicionado. El almacenamiento (24ºC, 4 meses) de las bebidas enriquecidas no produce cambios en el contenido de EV, si bien, existe un incremento significativo del contenido de POPs durante dicho almacenamiento. Los valores de BA indican diferencias en la solubilidad de los EV dependiendo de la longitud de la cadena alquílica, siendo el campesterol el más bioaccesible. En el caso de los POPs, la BA es superior que en el caso de los EV y, de entre ellos, el sitostanotriol es el más bioaccesible. Los resultados relativos a los efectos biológicos causados por los 7-cetoesteroles en células Caco-2 señalan, principalmente, el compartimento mitocondrial como principal diana de su citotoxicidad, siendo el efecto causado por el 7-cetocolesterol superior al del 7-cetoestigmasterol. La presencia conjunta de ambos 7-cetoderivados, indica una interacción negativa, mostrando una reducción del efecto tóxico del derivado del colesterol. No obstante, la expresión de biomarcadores (NFκB, TNFα, receptor IL-1β) y la cuantificación de citoquinas (TNFα, IL-8, IL-10) pone de manifiesto el mayor potencial inflamatorio del 7-cetoestigmasterol. La monitorización de la expresión relativa de transportadores (NPC1L1, ABCG5/8) y enzimas (HMGCoA, ACAT) relacionados con el metabolismo del colesterol, indican que el poder reductor y el ATP están directamente relacionados con el metabolismo de los 7-cetoesteroles, sin embargo, la influencia del calcio intracelular parece ser determinante en las células incubadas con 7-cetoestigmasterol. El estudio preliminar sobre el potencial efecto citotóxico de los 7-cetoderivados sobre células HepG2 indica una mayor susceptibilidad de esta línea celular versus las células Caco-2, hecho de especial relevancia dado que el metabolismo de los compuestos lipídicos tiene lugar en el hígado. En general, los efectos observados indican que pequeños cambios en la estructura química de los productos de oxidación de los esteroles condicionan el efecto fisiológico determinado in vitro.

Cholesterol has been associated with diseases related to cardiovascular risk. The cholesterol-lowering effect (10-15%) of plant sterols (PS) is widely known, but the intake required (2-3 g/day) to achieve this effect is higher than the dietetic intake. Plant sterols are therefore used in food enrichment – margarine being the first enriched food of this kind. However, foods of this type are contrary to current dietary recommendations which indicate a lower fat intake. As a result, other foods with a better nutritional profile have been enriched with PS (milk, juice with milk, yogurt, etc.). Plant sterols can be oxidized, forming oxidation products (POPs). Studies on the biological effects of POPs are scarce and sometimes contradictory. Due to their structural similarity, the effects caused by cholesterol oxidation products (COPs) are attributed to POPs, which have been implicated in a number of pathologies related to the modulation of lipid metabolism and cellular dysfunction. The objective of this thesis is the study of PS and POPs in fruit and/or milk-enriched beverages, by selecting an ingredient source of PS, investigating the stability of PS and the bioavailability (BA) of the PS and POPs present in these beverages and used as part of a clinical intervention study in humans. Moreover, the biological effects of 7-ketoderivatives of stigmasterol and cholesterol have been evaluated in intestinal epithelial cell cultures (Caco-2) as a first physiological barrier for the absorption of these compounds. The evaluation of biological effects included the determination of cytotoxicity caused by 7-ketosterols (evaluating lysosomal activity, mitochondrial function and integrity, and nucleic acids content), their inflammatory potential (via the relative expression (mRNA) of biomarkers (NFκB, TNFα, IL-1β receptor) and the quantification of cytokines (TNFα, IL-1β, IL-8, IL-10)), and their effect upon the modulation of cholesterol metabolism (monitoring protein transporters (NPC1L1, ABCG5/8) and enzymes (HMGCoA, ACAT)). The identification of POPs by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) has been optimized (collision energies) for the subsequent detection of these compounds in the beverages used in this thesis. After evaluating two ingredients for PS enrichment, tall oil has been chosen. This ingredient allows better PS quantification (decreasing formation of emulsions and increasing reproducibility in both matrixes (juice and juice with milk)) in the enriched beverages. The storage (24°C, 4 months) of fortified beverages induces no changes in PS content, though there is a significant increase in POPs content. BA values indicate differences in the solubility of PS depending on the length of the alkyl chain - campesterol being the most bioavailable molecule. In the case of POPs, BA is higher than for PS - the most bioavailable molecule in this case being sitostanotriol. The results of the biological effects caused by 7-ketosterols in Caco-2 cells show the main subcellular target to be the mitochondrial compartment - the effect caused by 7-ketocholesterol being greater than that of 7-ketostigmasterol. The combined presence of both 7-ketoderivatives indicates a negative interaction through reduction of the toxic effect induced by the cholesterol derivative. However, the biomarkers expression (NFκB, TNFα, receptor IL-1β) and the cytokines quantification (TNFα, IL-8, IL-10) attributes the greatest inflammatory potential to 7-ketostigmasterol. The relative expression of transporters (NPC1L1, ABCG5/8) and enzymes (HMGCoA, ACAT) related to cholesterol homeostasis indicates that the reducing power and ATP are directly related to the metabolism of 7-ketosterols, but the influence of intracellular calcium appears to be determinant in cells incubated with 7-ketostigmasterol. The preliminary study on the potential cytotoxic effect of 7-ketoderivatives upon HepG2 cells indicates a greater susceptibility of this cell line versus Caco-2 cells. This is of particular relevance, because lipid metabolism takes place in the liver. In general, the observed effects indicate that small changes in the chemical structure of the sterol oxidation products condition the physiological effects observed in vitro.