Estudios in vitro de mecanismos de transporte y toxicidad de especies arsenicales a nivel intestinal

El arsénico es un metaloide ampliamente distribuido en el medioambiente, del cual existen numerosas formas químicas con características toxicológicas muy diferentes. En la actualidad, las formas inorgánicas son la que mayor interés despiertan, ya que se consideran carcinogénicas para el hombre. Se estima que alrededor de 140 millones de personas están afectadas por consumo de agua contaminada con niveles de arsénico que superan los máximos recomendados por la Organización Mundial de la Salud (10 µg/L). Los problemas de salud derivados de la exposición a este contaminante alcanzan gran magnitud en ciertas áreas geográficas de India, Bangladesh y Argentina, donde por características geológicas de los terrenos el contenido de arsénico en los acuíferos subterráneos es elevado. La principal forma de arsénico presente en el agua de bebida es el As(V). En la presente tesis se ha corroborado que previamente a la ingesta del arsénico (procesado de los alimentos por remojo y cocción) y durante su paso a través del tracto gastrointestinal, la matriz alimentaria modifica la forma química del arsénico, dando lugar a otras especies de mayor toxicidad. Adicionalmente se ha evidenciado por primera vez la capacidad de metabolizar el arsénico inorgánico por células del epitelio intestinal, indicando que en los estudios sobre el metabolismo presistémico del arsénico inorgánico, que hasta el momento sólo consideraban el metabolismo hepático, habría que incluir las transformaciones asociadas al metabolismo intestinal. La presencia de distintos compuestos habitualmente presentes en el lumen, tales como GSH y vitamina B12, afectan a los patrones de metabolismo. Todas estas modificaciones en las formas químicas del arsénico que se ingieren con agua o alimentos contaminados amplían la complejidad en la evaluación del riesgo asociado al consumo de este metaloide. En esta tesis se ha evidenciado que las transformaciones presistémicas del arsénico pueden influir en su absorción por el epitelio intestinal, ya que las formas trivalentes se absorben con mayor facilidad que las pentavalentes por las células Caco-2 utilizadas como modelo in vitro. Asimismo se han identificado distintas vías de asimilación, poniendo de manifiesto que la ruta paracelular tiene una gran participación en la absorción intestinal de la mayoría de formas arsenicales, con excepción del MMA(III) y DMA(III). A pesar de ello, la presencia combinada de transporte transcelular y paracelular parece estar presente en la mayoría de especies arsenicales. Por otra parte, la influencia del pH en la captación de As(V) y DMA(V) indica su posible absorción en las zonas proximales del intestino. Se han estudiado con más detalle los mecanismos de captación celular del arsénico inorgánico, al tratarse de la especie mayoritaria en agua de bebida, principal fuente de exposición a este tóxico. Se ha evidenciado la multiplicidad de transportadores implicados en este proceso [As(III): AQ10, OATPB, GLUT5; As(V): NaPiIIb]. Así mismo se han puesto de manifiesto modificaciones de los patrones de expresión génica de estos y otros transportadores presentes a nivel intestinal que participan en la absorción de sustancias esenciales y en los procesos de detoxificación celular. Considerando la complejidad celular existente en el intestino, en esta tesis se ha evaluado la influencia de modelos celulares mixtos entre células epiteliales absortivas (Caco-2) y células secretoras de mucus (HT29-MTX) sobre la captación y transporte de especies arsenicales. El cambio en la estructura de las uniones estrechas y la presencia de mucus en la monocapa celular mixta, influyen significativamente en el transporte de la mayoría de las especies arsenicales estudiadas, con excepción del As(III). La absorción de las especies pentavalentes se ve incrementada por la mayor apertura de las uniones estrechas en este modelo. Por el contrario la permeabilidad de las formas metiladas trivalentes se reduce debido a la presencia de mucus, aspecto que evidencia la importancia de este mecanismo de defensa frente a especies arsenicales altamente reactivas y tóxicas. Todo ello apunta a la importancia del modelo celular empleado en los estudios sobre la absorción in vitro de arsénico. Así mismo las distintas transformaciones descritas tienen consecuencias a nivel toxicológico, ya que como se ha evidenciado en la presente tesis, la toxicidad de las formas arsenicales es variable, siendo baja para las formas pentavalentes a los niveles que pueden presentarse en el agua de bebida y muy superior para las formas trivalentes. El mecanismo por el cual las distintas formas arsenicales inducen toxicidad parece tener un factor común, que es la generación de especies reactivas de oxígeno, con un desbalance en las defensas antioxidantes celulares que depende de la especie y de la concentración (descenso del GSH, modificación de la actividad de enzimas catalasa y glutatión peroxidada, cambios en la expresión génica de metalotioneínas y proteínas de choque térmico). Sin embargo, los mecanismos de muerte celular varían entre especies, indicando diferencias en los procesos de toxicidad. Adicionalmente, se ha puesto de manifiesto que el arsénico inorgánico trivalente es capaz de causar una desestructuración del citoesqueleto celular formado por actina filamentosa. La estrecha relación entre los procesos derivados del estrés oxidativo y los procesos inflamatorios es de especial importancia a nivel entérico, donde los procesos asociados a la inflamación y la respuesta inmune están en continua regulación para mantener la homeostasis intestinal. En esta tesis se pone de manifiesto que las formas arsenicales trivalentes inducen la liberación de citoquinas proinflamatorias en los sistemas in vitro formados por monocultivos de células Caco-2 o por cocultivos de Caco-2/PBMC, indicando que tanto el arsénico inorgánico ingerido como las formas derivadas del metabolismo o transformaciones intestinales son capaces de inducir una respuesta proinflamatoria. La presencia adicional de un agente inmunógeno como el lipopolisacárido de Salmonella enterica var. typhymurium, aumenta la respuesta del arsénico, especialmente del As(III), indicando que en lugares donde ambos factores (arsénico + contaminación bacteriana) coexisten en agua de bebida, pueden generarse importantes respuestas inflamatorias a nivel intestinal, cuyas consecuencias deberían ser estudiadas en profundidad, especialmente en niños, cuyo sistema inmune está en desarrollo y por tanto la susceptibilidad y efectos de estos procesos inflamatorios intestinales pueden ser más graves. La inducción de estrés oxidativo, junto con los efectos proinflamatorios y los cambios en la estructura del citoesqueleto celular en células Caco-2 expuestas a distintas formas arsenicales afecta a la permeabilidad paracelular del epitelio, indicando que este tóxico puede alterar la funcionalidad del epitelio como barrera frente a agentes externos.

Arsenic is a metalloid that is widely distributed in the environment, appearing in numerous chemical forms with very different toxicological characteristics. The inorganic forms are the ones that currently arouse most interest, since they are considered carcinogenic for humans. It is estimated that about 140 million people are affected by consumption of contaminated water with arsenic levels exceeding the maximum levels recommended by the World Health Organization (10 µg/L). The health problems derived from this contaminant are of great magnitude in some parts of India, Bangladesh and Argentina, where arsenic concentrations in underground aquifers are high because of the geological characteristics of those areas. The main form of arsenic present in drinking water is As(V). In this thesis it has been verified that prior to ingestion of arsenic (processing of foods by soaking and boiling) and during its passage through the gastrointestinal tract the food matrix modifies the chemical form of arsenic, producing other species of greater toxicity. Furthermore, it is shown for the first time that intestinal epithelial cells have the capacity to metabolize inorganic arsenic, indicating that in studies on presystemic metabolism of inorganic arsenic, which have previously only considered hepatic metabolism, it is necessary to include the transformations associated with intestinal metabolism. Metabolism patterns are affected by the presence of various compounds that are commonly found in the lumen, such as GSH and vitamin B12. All these alterations in the chemical forms of arsenic that are ingested with contaminated water or food increase the complexity of evaluating the risk associated with consumption of this metalloid. In this thesis it is shown that presystemic transformations of arsenic can influence its absorption by the intestinal epithelium, since the trivalent forms are absorbed more easily than the pentavalent forms by the Caco-2 cells used as an in vitro model. Various assimilation pathways are also identified, showing that the paracellular pathway plays an important part in intestinal absorption of most forms of arsenic, with the exception of MMA(III) and DMA(III). Nevertheless, a combination of transcellular and paracellular transport seems to be present in most species of arsenic. Furthermore, the influence of pH on uptake of As(V) and DMA(V) indicates their possible absorption in the proximal parts of the intestine. A more detailed study is made of mechanisms for cellular uptake of inorganic arsenic, because it is the major species in drinking water, the main source of exposure to this toxin. It is shown that many transporters are involved in this process [As(III): AQ10, OATPB, GLUT5; As(V): NaPiIIb]. It is also shown that there are alterations in the patterns of gene expression of these and other transporters present in the intestine which take part in the absorption of essential substances and in cell detoxification processes. In view of the cellular complexity of the intestine, the influence of mixed cell models, comprising absorptive epithelial cells (Caco-2) and mucus-secreting cells (HT29-MTX), on uptake and transport of arsenic species is evaluated. The change in the structure of tight junctions and the presence of mucus in the mixed cell monolayer have a significant influence on transport of most of the arsenic species studied, with the exception of As(III). Absorption of the pentavalent species is increased by the greater opening of tight junctions in this model. On the other hand, the permeability of trivalent methylated forms is reduced by the presence of mucus, an aspect that shows the importance of this defence mechanism against highly toxic, reactive arsenic species. All this indicates the importance of the cell model employed in studies on in vitro absorption of arsenic. The various transformations described also have consequences on a toxicological level, since, as is shown, the toxicity of arsenic forms is variable, being low for the pentavalent forms at the levels that may be present in drinking water and much higher for the trivalent forms. The mechanisms by which the various forms of arsenic induce toxicity appear to have a common factor, the generation of reactive oxygen species, with an imbalance in cellular antioxidant defences which depends on the species and the concentration (decrease in GSH, alteration in activity of catalase and glutathione peroxidase enzymes, changes in gene expression of metallothioneins and heat shock proteins). However, cell death mechanisms vary between species, indicating differences in toxicity processes. Furthermore, it is shown that trivalent inorganic arsenic is capable of causing disruption of the cell cytoskeleton formed by filamentous actin. The close relationship between processes derived from oxidative stress and inflammatory processes is especially important on an enteric level, where processes associated with inflammation and immune response are constantly regulated to maintain intestinal homeostasis. In this thesis it is shown that trivalent arsenic forms induce the release of proinflammatory cytokines in in vitro systems consisting of monocultures of Caco-2 cells or cocultures of Caco-2/PBMC, indicating that both the inorganic arsenic ingested and the forms derived from intestinal transformations or metabolism are capable of inducing a proinflammatory response. The additional presence of an immunogenic agent, such as the lipopolysaccharide of Salmonella enterica var. typhimurium, increases the response of arsenic, especially As(III), indicating that in places where both factors (arsenic + bacterial contamination) coexist in drinking water substantial inflammatory responses may be generated in the intestine, with consequences that should be studied in depth, especially in children, whose immune system is developing and therefore their susceptibility and the effects of these intestinal inflammatory processes may be more serious. The induction of oxidative stress, together with proinflammatory effects and changes in the structure of the cell cytoskeleton in Caco-2 cells exposed to various forms of arsenic, affects the paracellular permeability of the epithelium, indicating that this toxin may alter the functionality of the epithelium as a barrier to external agents.