Unraveling new mechanisms of postembryonic organ formation in Arabidopsis thaliana roots through computational and in vivo approaches

La organogénesis postembrionaria es vital para el desarrollo de las plantas y su adaptación a las condiciones cambiantes del entorno. Bajo tierra, las raíces laterales (LRs) suponen la mayor parte del sistema radicular en Arabidopsis. La formación de LR es un proceso de desarrollo que pueden dividirse en dos etapas: la fase de pre-patterning y la fase formativa. La fase de pre-patterning se inicia en una región cerca de la punta de la raíz que se conoce como Zona de Oscilación (OZ). Esta región se caracteriza por la presencia de un oscilador molecular llamado el Reloj de la Raíz, que genera pulsos periódicos de expresión génica que pueden detectarse gracias a la actividad del promotor sintético DR5. Conforme las células salen de la OZ, un pico de expresión de DR5 lleva a la imprimación de algunas células, que adquieren una expresión permanente de este marcador para formar lo que se conoce como sitio de pre-ramificación (PBS). Así, la actividad cíclica del Reloj de la Raíz lleva al establecimiento periódico de PBS, que marcan los sitios para la futura emergencia de LRs. Algunas células de los PBS serán especificadas como células fundadoras (FC) de LR. La fase formativa se inicia cuando las FC sufren polarización y migración nuclear, seguidas de varias rondas de división celular altamente reguladas a nivel genético, primero anticlinal y luego periclinalmente. Tras esto, suceden varias rondas de división celular adicionales que comienzan a generar un primordio (LRP) en forma de domo que se desarrolla a través de varios estadios (I-VII) y que adquiere progresivamente la organización tisular característica de la raíz principal. Finalmente, la nueva LR terminará por emerger a través de los tejidos que la recubren. El objetivo principal de esta tesis ha sido descifrar nuevos mecanismos regulatorios para la formación postembrionaria de LRs en Arabidopsis thaliana. Este trabajo se ha enfocado tanto en la fase de pre-patterning como en la fase formativa del proceso de formación de LR. En concreto, se pretendía profundizar en cómo la OZ, en la cual se localiza la actividad del Reloj de la Raíz, se limita a una región específica de la raíz principal. Además, se intentaba dilucidar cómo las identidades celulares se especifican en los estadios tempranos de la fase formativa, así como qué mecanismos moleculares regulan este proceso de histogénesis. Para investigar cómo la OZ se limita a una región específica de la raíz principal, se realizó un screening de etil metano sulfonato (EMS) en mutantes arf7arf19 que expresaban el marcador DR5:Luciferasa. Estos mutantes presentan una expresión constitutiva y no oscilante de DR5 en la OZ, facilitando por tanto la visualización permanente de esta región. Se generó un total de 1242 líneas mutantes M2, de las cuales se analizaron ~900 en busca de alteraciones en el patrón de expresión de DR5 en la OZ. Se pretendía encontrar mutantes con una expresión expandida de este marcador, ya que una expansión de la OZ indicaría la existencia de una señal represora, posiblemente desconocida, que estaría limitando esta región y que probablemente tendría un rol antagonista a las auxinas. Los mutantes seleccionados en el fondo genético arf7arf19 fueron clasificados en tipo A, que mostraban una expansión de la OZ, y tipo B, que presentaban una mayor intensidad de DR5 en la OZ sin alteraciones visibles en el tamaño de esta región. Entre los mutantes seleccionados, aquellos que mantenían un fenotipo constante en la descendencia fueron cruzados varias veces con la línea silvestre, que también expresaba el reportero DR5:Luciferase. Con esto, se eliminaron las mutaciones arf7 y arf19, así como otras mutaciones no causales del fenotipo generadas en el proceso de mutagénesis por EMS. Finalmente, se seleccionó un total de 8 mutantes para el mapeo de sus mutaciones causales mediante secuenciación de nueva generación (NGS). En estos mutantes se incluían 6 mutantes de tipo A (OZ#8, OZ#439, OZ#652, OZ#686, OZ#752 y OZ#780) que presentaban alteraciones en el tamaño de la OZ, así como variaciones en el desarrollo relacionadas con la longitud de la raíz principal y la formación de PBS y LR. Los otros dos mutantes (OZ#235 y OZ#414) se clasificaron como tipo B y presentaban un aumento de la intensidad de DR5 en la OZ, así como defectos en el crecimiento de la raíz principal y/o en la formación de PBS y LR. En base a la secuenciación y a análisis computacionales, se propusieron mutaciones candidatas para todos los fenotipos mutantes, excepto para OZ#752 y OZ#780, cuyo proceso de secuenciación generó resultados de baja calidad. Cuatro de las mutaciones propuestas consistían en polimorfismos que generaban codones de STOP o errores de splicing. La mutación del mutante OZ#439 consistía en un codón de STOP prematuro en un dominio de receptor tirosina quinasa, lo cual sugería un papel para una quinasa receptora con repeticiones ricas en leucina en la limitación de la OZ, la formación de PBS y la regulación del crecimiento de la raíz principal. Evidencias genéticas sugieren que la mayoría de los tejidos de la LR se inician durante estadios tempranos de la formación de LR (I-IV). Para investigar si existen diferentes identidades celulares en estos estadios tempranos de desarrollo, se realizó un análisis por secuenciación de RNA de célula única (scRNA-seq). Se seleccionaron exclusivamente las células del LRP mediante la utilización de una línea que expresaba el promotor específico de LRP HOMEOBOX 53 (pHB53) fusionado a la proteína fluorescente mCherry y a una señal de localización nuclear (NLS). Para asegurar que se analizaban primordios hasta el estadio IV, se utilizaron las raíces de plántulas de 4 días, que contenían una mezcla de LRP de estadios entre I y IV. Las células deseadas se aislaron por protoplasting seguido de fluorescent activated cell sorting (FACS) y finalmente se sometieron a un análisis transcriptómico por scRNA-seq. Los análisis in silico de los datos transcriptómicos revelaron la existencia de 7 poblaciones celulares entre los estadios tempranos de desarrollo del LRP. Estas identidades podían diferenciarse por expresión génica y por el enriquecimiento de funciones biológicas específicas, y, en base a análisis computacionales, mostraban sólo similitudes parciales con las identidades conocidas de la raíz. Para validar las poblaciones celulares predichas in vivo, se seleccionaron biomarcadores específicos y se fusionaron sus regiones promotoras a proteínas reporteras fluorescentes para su expresión estable en líneas transgénicas. Seguidamente, se evaluó la expresión de estos marcadores en células de LRP a diferentes estadios de desarrollo mediante microscopía confocal. Se identificaron dos poblaciones celulares, llamadas células madre en transición a la endodermis/centro quiescente (QC) y células en transición al QC, que se encontraban enriquecidas en características de células madre y que predecían la formación de los linajes del tejido basal y el QC. Las células madre en transición a la endodermis/QC estaban marcadas por la expresión de CBF3 y aparecían en el estadio II-III del desarrollo del LRP. Las células en transición al QC estaban marcadas por la expresión de WOX5 y PLT4 y aparecían en el estadio IV de desarrollo del LRP. El análisis de la expresión de WOX5 en el mutante cbf3 llevó a la conclusión de que CBF3 se encontraba implicado en la transición entre las células madre en transición a la endodermis/QC y las células en transición al QC, ya que la pérdida de su función afectaba a la expresión de WOX5 y generaba defectos en el desarrollo del LRP. Estos resultados definían una nueva trayectoria que generaría el nuevo nicho de células madre del LRP. Además, se identificaron tres poblaciones celulares; llamadas células similares a la vasculatura 1, células similares a la vasculatura 2 y células similares al protofloema, que reflejaban el inicio de la adquisición de una identidad similar a la vascular. Las células similares a la vasculatura estaban marcadas por la expresión de MYB108 y aparecían en el estadio II-III del desarrollo del LRP. Las células similares al protofloema estaban marcadas por la expresión de ATHMP41 y aparecían en el estadio IV del desarrollo del LRP. Curiosamente, las células similares al protofloema se localizaban en una posición adyacente al floema de la raíz principal (que también presentaba expresión de ATHMP41), lo que sugería una conexión vascular temprana del LRP con la raíz principal, así como una trayectoria vascular temprana independiente de la especificación de células madre. Finalmente, se identificaron dos poblaciones celulares, llamadas células primordiales y células flanqueantes, que se encontraban restringidas a los flancos del LRP en estadios tardíos de su desarrollo. Las células primordiales estaban marcadas por la expresión de DR4 y aparecían desde el estadio I, para luego ser restringidas a los flancos del LRP; momento en el que las células flanqueantes, marcadas por la expresión de MYB36, representaban un subconjunto de esta población precursora. La correlación espaciotemporal entre los marcadores descritos sugería la existencia de relaciones de desarrollo entre las distintas identidades celulares. Por ello, se realizaron análisis de conectividad y pseudotemporales para investigar la ontogenia de las siete poblaciones celulares identificadas. Las transiciones predichas por estos análisis fueron validadas mediante experimentos de ablación láser, ya que la regeneración del primordio tras la ablación implicaba una recapitulación secuencial de la ontogenia de desarrollo del LRP. Los resultados de estos análisis llevaron al establecimiento de un modelo en el que un único grupo de células precursoras se reprograma rápidamente para diversificarse en tres ramas de desarrollo, que darán lugar a un dominio central de células madre similares al tejido basal y el QC, un sistema vascular temprano a los lados del LRP y una región flanqueante que contiene un reservorio de células madre pluripotentes. Estas células madre conservadas en los flancos demostraron la capacidad de generar una nueva LR tras un daño. Por todo esto, se concluyó que la histogénesis del LRP es jerárquica y se organiza en al menos tres trayectorias de desarrollo. Con el objetivo de analizar los circuitos genéticos que controlaban esta jerarquía de desarrollo, se generó una red de regulación génica (GRN) para la histogénesis temprana de LR. En esta red, se predecía que nuevas familias de proteínas regulaban el establecimiento de la identidad de células en transición al QC. Se analizaron mutantes de pérdida de función y se observaron defectos en el desarrollo de la LR, así como en la morfología del LRP. Con ello, se validó el potencial de la GRN generada para la identificación de nuevos reguladores. La división y el crecimiento celulares se han relacionado con la determinación del destino celular y con la regulación de la morfología de los órganos. Por tanto, se decidió analizar la importancia de estas fuerzas en la organogénesis de LRP. Para ello, se utilizó la técnica de microscopía fluorescente light-sheet (LSFM) para generar grabaciones en 4D del desarrollo de LRP en varias líneas que expresaban marcadores fluorescentes. En concreto, estas líneas expresaban dos marcadores: uno que marcaba la identidad de cada una de las poblaciones celulares previamente descritas, y otro de otro color que delimitaba el contorno celular. Se generó un total de 6 vídeos de unas 20 horas de duración para la visualización de los marcadores de las distintas identidades celulares. Además, se realizó un análisis de seguimiento del linaje celular para el vídeo de la línea fluorescente que expresaba el marcador pDR4::NLS-3xYFP, utilizando el software MaMuT para examinar el establecimiento de esta identidad a lo largo del tiempo. Este análisis mostró que la tasa de división celular de las células del LRP está influenciada tanto por la identidad celular (marcada por DR4) como por la información posicional. Curiosamente, la identidad marcada por DR4 se perdía en las regiones centrales del primordio sin necesidad de división celular, mientras que la recuperación de esta identidad era rara. En conjunto, el presente estudio ha identificado potenciales mecanismos nuevos que regulan el posicionamiento de la OZ para el pre-patterning de las LR. Además, se han generado evidencias de una jerarquía en la ontogenia del desarrollo de LR y se ha profundizado en los circuitos genéticos que regulan este proceso. Por tanto, este trabajo aporta información en cuanto a la difícil pregunta de cómo las plantas dirigen procesos de desarrollo para el establecimiento y la formación de nuevas estructuras. ABSTRACT Postembryonic organogenesis is critical for plant development and adaptation to changing environmental conditions. Underground, lateral roots (LRs) form the bulk of the mature root system in Arabidopsis. LR formation is a multistep developmental process that can be divided into a pre-patterning stage and a formative stage. The pre-patterning stage initiates at a region close to the root tip called the Oscillation Zone (OZ). The OZ is characterized by the activity of a molecular oscillator called the Root Clock, which generates periodic pulses of gene expression that can be reported by the synthetic promoter DR5. As cells exit the OZ, a peak of DR5 expression leads to the imprinting of some cells which acquire permanent expression of DR5 to form a pre-branch site (PBS). The cyclic activity of the Root Clock leads to the periodic establishment of PBS, underpinning the sites for LR emergence. PBS cells will be later specified as LR founder cells (FC). The formative stage initiates when FC undergo polarization and nuclear migration followed by several rounds of tightly regulated cell divisions, first anticlinally and then periclinally. After that, multiple additional rounds of cell division start generating a dome shaped LR primordium (LRP) that grows through several developmental stages (I-VII) and progressively acquires the characteristic tissular organization of the primary root. The new LR will eventually emerge across the overlaying tissues. The main goal of this Ph.D thesis was to decipher new regulatory mechanisms of postembryonic LR formation in Arabidopsis thaliana. This work focused both on the pre-patterning stage and on the formative stage of LR formation. We aimed to deepen the knowledge about how the OZ, where the Root Clock activity is located, is delimited to a region of the primary root. In addition, we tried to unravel how different cell identities are specified at the early phases of the LR formative stage and which regulatory mechanisms govern the histogenesis process. To investigate how the OZ is delimited to a specific region of the primary root, we performed a screening using ethyl methanesulfonate (EMS) on arf7arf19 mutants carrying the DR5:Luciferase marker. arf7arf19 mutants show constitutive non-oscillating expression of DR5 in the OZ, thereby facilitating the permanent visualization of this region. A total of 1242 mutagenized M2 lines were generated, from which ~900 lines were screened for alterations in the DR5 pattern of expression in the OZ. We aimed to find mutants with expanded DR5 marker expression, as expansion of the OZ would indicate the existence of a repressing signal delimiting the OZ, likely unknown, and probably with an antagonistic role to auxin. Mutants selected in arf7arf19 genetic background were classified into type A, which showed an expansion of the OZ, and type B, which presented higher DR5 intensity in the OZ without visible alterations in the OZ size. Selected mutants that maintained a constant phenotype were backcrossed several times with the wild type carrying the DR5:Luciferase reporter. With this, we removed the arf7 and arf19 mutations and aimed to get rid of other non-causal mutation generated by the EMS mutagenesis process. Finally, a total of 8 mutants were selected for mapping through next generation sequencing (NGS). These included 6 type A mutants (OZ#8, OZ#439, OZ#652, OZ#686, OZ#752 and OZ#780) that showed alterations in the size of the OZ as well as developmental alterations related to primary root growth, and PBS and LR formation. The other two mutants (OZ#235 and OZ#414) were classified as type B and showed increased DR5 intensity in the OZ and developmental defects of primary root growth and/or PBS formation. According to genome sequencing and bioinformatics analyses, we proposed candidate mutations for all the mutant phenotypes, except for OZ#752 and OZ#780, whose sequencing process rendered low quality results. Four of the proposed mutations consisted in polymorphisms generating STOP codons or incorrect splicing. The mutation of OZ#439 consisted in a premature STOP codon in a receptor tyrosine kinase domain, suggesting a role for a leucin-rich-repeat-receptor-like kinase in limiting the OZ, PBS formations and the regulation of the primary root growth. Genetic evidence suggests that most LR tissues are initiated during early stages of LR formation (I-IV). To investigate whether there were different cellular identities at these early developmental stages, we performed a single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. We exclusively selected LRP cells by using a line expressing the LRP-specific promoter of HOMEOBOX 53 (pHB53) fused to the mCherry fluorescent protein and a nuclear localization signal (NLS). To ensure that we profiled LRP up to stage IV, we used 4-day-old roots, which, under our growth conditions, contained a mixture of LRP from stage I to stage IV. The desired cells were isolated by protoplasting followed by fluorescent activated cell sorting (FACS) and subjected to transcriptomic profiling by scRNA-seq. In silico analysis of the transcriptomic data revealed 7 populations within the early stages of LRP development. These cell identities could be differentiated by specific gene expression and enriched biological functions and showed only partial similarities with previously known root identities according to computational calculations. To validate the predicted cell populations in vivo, we selected specific biomarkers and used their promoter regions to drive expression of fluorescent reporter proteins in stably transformed plant lines. Next, we evaluated their pattern of expression in LRP cells at different stages through confocal laser microscopy. We identified two LRP cell populations, named Endodermis/QC-transitioning stem cells and QC-transitioning cells, that were enriched in stem cell–like features and predicted the formation of the ground tissue and QC lineages. Endodermis-QC-transitioning stem cells was marked by CBF3 expression and appeared at stage II-III of LRP development. QC-transitioning cells were marked by WOX5 and PLT4 expression and appeared at stage IV of LRP development. Analysis of WOX5 expression in the cbf3 mutant led to the conclusion that CBF3 was involved in the transition between endodermis/QC-transitioning cells and QC-transitioning cells, as the loss of its function affected WOX5 expression in association with a LRP formation phenotype. These results define a developmental trajectory forming the new stem cell niche of the LRP. Additionally, we identified three LRP cell populations; named vascular-like 1, vascular-like 2 and protophloem-like cells, reflecting early vascular-like identity acquisition. Vascular-like cells were marked by MYB108 expression and appeared at stage II-III of LRP development. Protophloem-like cells were marked by ATHMP41 expression and appeared at stage IV of LRP development. Interestingly, protophloem-like cells were adjacent to the phloem tissues of the primary root (also marked by ATHMP41), suggesting an early vasculature connection of the LRP to the primary root and an early vascular developmental trajectory independent of stem cell specification. Finally, two LRP populations, named primordial and flanking cells, were restricted at the flanks at late stages of LRP development. Primordial cells were marked by DR4 expression and appeared at stage I to be later restricted to the flanks of the LRP; where flanking cells, marked by MYB36 expression, represented a subset of this precursor population. The spatio-temporal correlations between the described biomarkers suggested the existence of developmental relationships between cell identities. Thereby, we performed connectivity and pseudotime analyses to investigate the ontogeny of the seven cell populations identified. The predicted transitions were validated by ablation experiments, as the regeneration of the LRP after ablation involved the sequential recapitulation of the LRP ontogeny. Our analyses led to a model in which a single group of precursor cells rapidly reprograms and splits into three developmental branches giving rise to a central domain of stem cells similar to the ground tissue and the QC, an early vascular system at the sides and a flanking region that includes a pluripotent stem cell reservoir. This stem cells maintained at the flanks were able to generate a new LR after damage. Thus, histogenesis of the LRP is hierarchical and organizes in at least three developmental trajectories. In order to analyze the genetic circuits driving this developmental hierarchy, we reconstructed a gene regulatory network (GRN) for early LR histogenesis. In this network, new protein families were predicted to regulate the establishment of the QC-transitioning cells. We analyzed loss-of-function mutants and observed defects in LR growth and LRP morphology. These results validate the potential of the generated GRN for the identification of novel regulators. Cell division and growth have been linked to the determination of cell fate and the shaping of organ morphology. Thereby, we wanted to address the importance of these forces in LRP organogenesis. For this, we used Light Sheet-based Fluorescence Microscopy (LSFM) for the generation of 4D recordings of developing LRP in several fluorescent marker lines. These marker lines simultaneously expressed a marker of one of the previously described cell identities and a different color marker of the cell membrane for the definition of cellular shape. A total of 6 videos of around 20 hours were generated for the visualization of markers of different cell identities. In addition, the recording of the fluorescent line expressing pDR4::NLS-3xYFP was analyzed with MaMuT to track the establishment of this cell lineage over time. This lineage tracing analysis showed that the cell division rates of the LRP cells are influenced by cell identity (marked by DR4) and positional information. Interestingly, DR4 identity was lost in the central regions of the LRP without a requirement for cell division while its recovery was a rare event. Collectively, this study identified potential novel mechanisms regulating the positioning of the OZ for LR pre-patterning. In addition, we provided evidence of an ontological hierarchy for LR formation and gained insight into the genetic circuits governing this process. Thus, this work sheds light on the long-term question of how plants conduct developmental programs.