Estudio del impacto de los programas de mejora genética para la producción de leche en los espermatozoides criopreservados de morueco

El incremento en la producción lechera obtenido de la puesta en marcha de programas de mejora genética en ovino de leche ha sido notable. Como contrapartida, los progresos alcanzados a nivel productivo han llevado asociados un deterioro en los aspectos fisiológicos y funcionales, siendo especialmente importantes los relacionados con la eficiencia reproductiva de los animales. Los programas de mejora genética, además, desempeñan un papel fundamental en la conservación y utilización de los recursos genéticos. La creación de bancos de recursos genéticos lleva consigo la criopreservación de los gametos, que, en el caso de los espermatozoides de mamíferos, dicho proceso puede dar lugar a cambios bioquímicos y funcionales que limiten su capacidad fecundante. Estos efectos negativos pueden ser causados por la formación de cristales de hielo y el estrés osmótico que se generan debido a los procesos de congelación y descongelación, pero es el aumento del estrés oxidativo uno de los mayores causantes de estas limitaciones. Debido a su particular arquitectura, el aumento de las condiciones de estrés oxidativo afecta especialmente a los espermatozoides de rumiantes, ya que estos presentan una elevada proporción de ácidos grasos poliinsaturados en sus membranas. Esto puede dar lugar a un daño en estructuras y moléculas tan importantes como el ADN. Aunque el ADN de los espermatozoides de ovino se encuentra muy compactado, de manera habitual, para detectar posibles daños en el ADN se utiliza un ensayo de evaluación de la integridad de la cromatina espermática (Sperm Chromatin Structure Assay, SCSA®), pero esta técnica no permite distinguir si estas alteraciones se han producido por un aumento del estrés oxidativo o por otras causas. Diversos autores han sugerido la detección de 8-hidroxi-2¿- desoxiguanosina (8-OHdG) como un método eficaz para evaluar el daño en el ADN producido específicamente por estrés oxidativo. Por todo ello, en el capítulo 4 de la presente tesis doctoral llevamos a cabo un estudio en el que sometimos a muestras seminales de moruecos de la raza ovino Manchego a diferentes concentraciones de agente oxidante y se cuantificó el daño en el ADN utilizando SCSA® y un inmunoensayo de detección de 8-OHdG. Nuestros resultados mostraron que ambos métodos detectaron el daño en el ADN causado por estrés oxidativo solo en condiciones de elevada oxidación, siendo SCSA® un método más sencillo con resultados más precisos. Por ello concluimos que, no es necesario un ensayo específico, como la inmunodetección de 8-OHdG, para detectar daños en el ADN producidos por el estrés oxidativo en espermatozoides de morueco. Así, la técnica SCSA® será la elegida en el capítulo 6 para evaluar una posible influencia del programa de selección genética en la integridad de la cromatina espermática. Ante la disminución de la fertilidad que se produce como consecuencia del aumento de producción de leche en el programa de mejora genética de la raza ovina Manchega, en el capítulo 5 de la presente tesis doctoral, planteamos un estudio multigeneracional para determinar el impacto de este programa de mejora sobre los espermatozoides. Para ello utilizamos muestras seminales procedentes de siete generaciones distintas de moruecos, nacidos entre 1992 y 2009, que han sido seleccionados para el fenotipo “producción de leche” y que han permanecido criopreservadas hasta 25 años en el banco de germoplasma de la raza ovina Manchega. Después de la descongelación, evaluamos diferentes parámetros espermáticos relacionados con la fertilidad, como la motilidad, la viabilidad, el estado del acrosoma, la actividad mitocondrial y la fluidez de la membrana a las 0 h y 2 h de incubación a 37 °C, utilizando métodos analíticos cuyo uso no era tan común hace tres décadas, como los sistemas automáticos de análisis de imagen (CASA) y la citometría de flujo. Los resultados obtenidos en la evaluación de estos parámetros mostraron que las diferencias entre generaciones fueron pequeñas, pero la mayoría de ellos muestran una tendencia positiva hacia las generaciones más recientes. Esto indica que las muestras seminales criopreservadas de las generaciones de moruecos más recientes en el programa de mejora genética analizadas presentan una mejor calidad que las muestras seminales de las generaciones anteriores. Con el fin de entender mejor el origen de estas diferencias entre generaciones, estimamos las tendencias genéticas de estos parámetros utilizando la información genealógica de la raza y la aplicación BLUPF90. Además, analizamos posibles cambios en genes que se han identificado como relacionados con los rasgos espermáticos evaluados mediante el uso de SNPs localizados dentro o cerca de estos genes, y examinamos si se producían cambios significativos en sus frecuencias alélicas y genotípicas a lo largo de las generaciones. En nuestros resultados no encontramos cambios significativos en las tendencias genéticas para ninguno de los parámetros evaluados. Tampoco encontramos cambios significativos en las frecuencias alélicas y genotípicas de los marcadores asociados a los genes de interés. Todos estos resultados sugieren que las pequeñas diferencias observadas entre generaciones son probablemente atribuibles a la criopreservación y no al propio proceso de selección genética. Es por ello que, en el capítulo 6 decidimos ampliar el estudio abordado en el capítulo anterior poniendo un mayor énfasis en las posibles variaciones en los niveles de estrés oxidativo derivadas de los procesos de criopreservación, debido a la creación de bancos de recursos genéticos, y su posible impacto en la estructura y funcionalidad de los espermatozoides. Por ello, evaluamos biomarcadores del estrés oxidativo, como la producción de ROS intracelular y los niveles de peroxidación lipídica, así como la integridad de la cromatina y la viabilidad en las mismas muestras espermáticas criopreservadas. Los resultados obtenidos en este capítulo 6 demuestran que los cambios en estos parámetros a través de las distintas generaciones han sido mínimos. Sin embargo, se observó una tendencia negativa para los biomarcadores relacionados con el estrés oxidativo, mientras que, para los parámetros relacionados con la fertilidad, como la viabilidad, esta tendencia fue positiva. Esto indica que en las muestras que han sido congeladas recientemente, el impacto del estrés oxidativo sobre la calidad de la muestra seminal ha sido menor. Además, con el fin de descartar una posible influencia del propio proceso de selección del programa de mejora genética de la raza, se realizó un estudio genético similar al realizado en el capítulo anterior para estos parámetros. Los resultados obtenidos en la evaluación de las tendencias genéticas no mostraron diferencias significativas. Todos estos resultados refuerzan la idea de que la criopreservación es la causante de las pequeñas diferencias observadas en estos estudios, concretamente el tiempo de almacenamiento, ya que los procesos de congelación y descongelación de estas muestras seminales se ha mantenido invariable desde el inicio del programa de mejora genética. Además, nos permiten descartar el efecto del propio proceso de selección genética en la calidad de las muestras seminales.