Red clover isoflavonoids in feed, plasma and milk of ruminants

Forage legumes such as red clover (Trifolium pratense L.) are used due to their ability to fix atmospheric nitrogen. Red clover has a high crude protein content and sufficient digestible fibre. Red clover silage tends to increase dry matter intake and milk yield in dairy cows. The use of clover silage can lead to desirable changes in milk fatty acid composition, promote growth and increase live-weight gain in ewes and lambs. The literature review focuses on the principal isoflavones in red clover, their metabolism in the rumen and conjugation and excretion. The role of equol is reviewed regarding concentrations in plasma and milk. Red clover varieties studied contained isoflavones; formononetin (6.0–7.9 mg/g in dry matter (DM)), biochanin-A (3.7–6.1 mg/g in DM), genistein (0.5-0.6 mg/g in DM) and daidzein (0.2–0.30 mg/g in DM). There were significant differences in isoflavone contents. The isoflavone content was highest in cultivar Ilte, which had the highest concentration of formononetin. The effect of growing conditions (year), growth stage (harvest) and habitat (site) were significant for formononetin concentrations. The total isoflavone and formononetin concentrations were highest under poor weather conditions, at the northern location and with later harvest. In the feeding experiment, the ewes were fed red clover (RC) silage that contained on average 6.8 mg/g of formononetin in DM. Timothy/meadow fescue (Phleum pratense L./Festuca pratensis Huds.) grass silage did not contain any isoflavones. In the RC group, estimated daily intake of isoflavones was 10.5 g formononetin. The major part of formononetin ingested was metabolized, contributing to the increase of equol in the serum (average level of 7.7 mg/l). In HPLC analyses, the serum of ewes contained solely (S)-equol. The ewes of RC group gained weight faster (P<0.001) and were significantly heavier (P<0.01) at the end of the experiment. All ewes became pregnant. There were no significant differences in the time of conception, numbers or weight of foetuses or numbers of ovulations. The mass of the uterus was significantly greater (P<0.01) in the RC group compared with that in the control group. This difference was mainly explained by the increase of foetal fluids in the RC group (P<0.01). In the dairy cow feeding experiment, the RC silages contained 3.0–6.5 mg/g formononetin in DM. Grass silage did not contain any isoflavones. The formononetin contents of the red clover were highest for the shortest growthperiod. The daily intake per cow of daidzein was 1.7–2.6 g and of formononetin 27–76 g. The equol concentration in plasma was 4.6–8.4 mg/l. Intake of formononetin was strongly associated with the equol concentration in plasma (R2 0.71). Equol contents in plasma were significantly higher (P<0.01) for the RC than for the cows fed grass silage. Plasma equol contents were significantly higher (P<0.001) for fed silages, where the growth period were shortest. Equol concentrations in the milk of cows fed RC were 458–643 µg/l and daily secretion of equol in milk was estimated to be 12–19 mg/day. Intake of formononetin was only weakly associated with equol concentration in milk (R2 0.20). Equol concentrations were also analysed from organic and conventionally produced commercial milk samples. Organic skimmed milk contained 411 µg/l of equol and conventionally produced 62 µg/l. The HPLC method provided excellent accuracy and sensitivity for quantification of isoflavonoids from fodder, blood, and milk samples. (S)-equol was the main isoflavonoid detected. It is suggested that the estrogenic effects of metabolic equol in sheep reported earlier are solely or predominantly due to (S)-equol. In Finnish landrace sheep, the fecundity of ewes was not reduced by feeding RC. The volume of foetal fluids, however, increased, which could increase the risk of vaginal prolapse before term. A strong association between formononetin intake and equol concentration in plasma was demonstrated. The equol content in cow’s milk can be as high as 600 µg/l with RC silage feeding, even though only a small part of the formononetin is secreted into milk as the metabolite equol. Milk equol is derived from the formononetin of RC silage and RC-fed cows’ milk can be considered as a source of equol in human nutrition.

Typpeä sitovat palkokasvit ovat olennainen osa nurmirehuun perustuvaa kotieläintuotantoa. Pohjoismaissa parhaiten menestyvä palkokasvi on puna-apila. Sen viljely on arkipäivää luomutuotannossa ja nykyisin myös tavanomaisilla tiloilla. Märehtijöille puna-apila on hyvä rehu; se sisältää runsaasti raakavalkuaista ja hyvin sulavaa kuitua. Lypsylehmillä puna-apilaruokinta lisää kuiva-aineen syöntiä ja maidontuotantoa, lisäksi maidon rasva-happokoostumus paranee. Uuhilla ja karitsoilla puna-apilaruokinnan on todettu parantavan kasvua ja painonkehitystä. Puna-apila on myös tunnettu isoflavonoidien eli kasviestrogeenien mahdollisena lähteenä niin märehtijöille kuin ihmisille. Tässä väitöskirjassa selvitettiin puna-apilalajikkeiden isoflavonipitoisuuksia, puna-apilan sopivuutta uuhien ja lypsylehmien ruokintaan koe-olosuhteissa sekä puna-apilasta peräisin olevien isoflavonoidien pitoisuuksia tavanomaisesti tuotetussa ja luomumaidossa. Puna-apilalajikkeista löytyi eniten formononetiinia (6,0–7,9 mg/g kuiva-aineessa (KA)) ja biokaniini-A:ta (3,7–6,1 mg/g KA). Lajikkeiden isoflavonipitoisuudet erosivat toisistaan merkitsevästi; suurimmat pitoisuudet löytyivät Ilte-lajikkeesta. Kasvukauden olosuhteet, kasvuaste ja kasvupaikka vaikuttivat merkitsevästi daidtseiini- ja formononetiinipitoisuuksiin. Kylmä ja sateinen kasvukausi, pohjoinen kasvupaikka ja myöhäinen korjuuajankohta lisäsivät apilarehun pitoisuuksia. Uuhien ruokintakokeessa syömä puna-apilarehu sisälsi keskimäärin 6,8 mg/g KA formononetiinia. Kontrolliryhmä ruokittiin timotei/nurminatasäilörehulla, joka ei sisältänyt isoflavoneja. Apilaruokinnalla uuhet saivat keskimäärin 10,5 g formononetiinia päivässä. Formononetiini metaboloitui uuhien elimistössä edelleen ekuoliksi, joka on estrogeenisesti potentein metaboliitti (veren ekuolipitoisuus keskimäärin 7,7 mg/l). Ruokinnalla ei ollut vaikutusta uuhien tiinehtyvyyteen tai sikiöiden kokoon. Puna-apilaruokittujen uuhien kohdut olivat painavampia (P<0,01) kuin nurmirehulla ruokittujen uuhien. Ero selittyi pääasiassa isommalla sikiönestemäärällä (P<0,01). Puna-apilaa syöneiden uuhien elopaino kohosi nopeammin (P<0,001), ja ne olivat teurastettaessa painavampia (P<0,01) kuin nurmirehulla ruokitut uuhet. Lypsylehmien puna-apilarehu sisälsi 3,0–6,5 mg/g KA formononetiinia. Kontrollina käytetty nurmisäilörehu ei sisältänyt isoflavoneja. Lyhyimmän kasvuajan puna-apilarehussa formononetiinipitoisuudet olivat suurimmillaan. Lehmien päivittäinen annos formononetiinia oli 27–76 g ja verinäytteiden keskimääräinen ekuolipitoisuus 4,6–8,4 mg/l. Tämä riippui voimakkaasti rehun formononetiinipitoisuudesta (R2 0.71). Puna-apilaa syöneiden lehmien maidon ekuolipitoisuus vaihteli välillä 458–643 µg/l. Lehmät erittivät keskimäärin 12–19 mg ekuolia päivässä maitoon. Formononetiinin saannin ja maidon ekuolipitoisuuden välillä oli vain heikko yhteys (R2 0.20). Vähärasvainen luomumaito sisälsi 411 µg/l ekuolia ja tavanomaisesti tuotettu maito 62 µg/l. Suuren erotuskyvyn nestekromatografialla pystytään tarkasti tunnistamaan ja määrittämään märehtijöiden rehun, verinäytteiden ja maidon isoflavonoidipitoisuuksia. Märehtijöiden verinäytteistä löytyi pääasiassa ekuolia. Lampaiden verinäytteiden ekuoli oli S-ekuolia. On todennäköistä, että kirjallisuudessa lampailla havaitut metabolisen ekuolin estrogeeniset vaikutukset on aiheuttanut S-ekuoli. Lampaiden puna-apilaruokinta ei heikentänyt suomenlammasuuhien hedelmällisyyttä ruokintakokeessa. Apilaruokituilla tiineillä uuhilla havaittiin kuitenkin kohdussa enemmän sikiönesteitä, mikä voi lisätä emättimen ulosluiskahduksen mahdollisuutta lopputiineillä uuhilla. Lehmillä formononetiinin syönnin ja ekuolin plasmapitoisuuksien välillä oli vahva tilastollinen yhteys. Puna-apilaruokittujen lehmien maidossa voi olla 600 µg/l ekuolia, vaikka vain pieni osa rehun formononetiinista eritetään maitoon ekuolimetaboliittina. Suomalainen luomumaito sisältää ekuolia, mikä todennäköisesti johtuu runsaasta puna-apilan käytöstä luomutuotannossa. Puna-apilaruokittujen lehmien maito on yksi ekuolin lähde ihmisillä.

ei saavutettava