Validation of aflatoxin B1 and fumonisin B1 analysis in cereals using UPLC-MS/MS | UPLC-MS/MS-menetelmän validointi aflatoksiini B1:n ja fumonisiini B1:n analysointiin viljoissa

Mykotoksiinit ovat homesienten tuottamia, myrkyllisiä metaboliatuotteita, jotka ovat haitallisia ihmisille ja eläimille. Tunnetuista mykotoksiineista esimerkiksi aflatoksiini B1 (AFB1) ja fumonisiini B1 (FMB1) ovat vakavia uhkia ruoan turvallisuudelle. Nämä homemyrkyt esiintyvät viljoissa usein samanaikaisesti, ja niiden myrkylliset vaikutukset voivat olla synergisiä. Mykotoksiineja tuottavien sienten levinneisyyden on ennustettu laajenevan tulevaisuudessa ilmastonmuutoksesta johtuen, minkä seurauksena ruoan laatu ja saatavuus voivat vaarantua aiempaa enemmän. Tutkimuksen tavoitteena oli optimoida ja validoida menetelmä AFB1:n ja FMB1:n kvantitatiiviseen määrittämiseen viljoissa käyttäen vehnälesettä edustavana matriisina matriisikorjatulle kalibroinnille. Menetelmä perustui ultrakorkean erotuskyvyn nestekromatografia-tandemmassaspektrometriaan (UPLC-MS/MS) ja kvantitoinnissa käytettiin valittujen reaktioiden seurantatekniikkaa (MRM). AFB1 ja FMB1 uutettiin ravistelemalla näytettä ja uuttoliuosta vaakasuorassa 30 minuutin ajan. Uuttoliuos sisälsi 70 % asetonitriiliä ja 1 % muurahaishappoa. Puhdistuksessa käytettiin heksaania ja QuEChERS-menetelmää. Mykotoksiinien kromatografinen erottaminen tehtiin Acquity UPLC BEH C18 -kolonnilla ja tunnistus kvadrupoli-lentoaikamassaspektrometrilla. Vehnäleseessä massaspektrometrin signaali AFB1:lle heikentyi huomattavasti (matriisivaikutus: 20 %) ja FMB1:n signaali vahvistui hieman (matriisivaikutus: 108 %). Nämä vaikutukset saatiin kompensoitua kokonaan käyttämällä 13C-leimattuja sisäisiä standardeja ja matriisikorjattua kalibrointia. Kvantitointi toteutettiin vertaamalla analyytin (AFB1 tai FMB1) ja sen sisäisen standardin kromatografisten piikkien pinta-alan suhdetta niiden konsentraatioiden suhteeseen. Sekä AFB1:n että FMB1:n vasteet olivat lineaarisia mittausalueellaan (R2 ≥ 0,995), ja menetelmä antoi tarkkoja (saantoprosentti: 89‒92 %) ja täsmällisiä (toistettavuus: 3,3‒6,9 %) tuloksia määrityspäivien sisällä ja niiden välillä. Menetelmän määritysraja oli 1,0 ng/g molemmille mykotoksiineille. Analyysin mittausepävarmuus FMB1:lle vertailumateriaalissa oli 644 ± 86 ng/g (k = 2, norm.). Tutkimuksessa käytetty LC-QTOF-MS-menetelmä täytti Euroopan komission asetuksen (EY) N:o 401/2006 suoritusarvovaatimukset ja validoitu vehnälese osoittautui edustavaksi matriisiksi kauraleseelle ja maissijauholle.

Mycotoxins are toxic secondary metabolites of fungi which have adverse health effects on humans and animals. Among the mycotoxins, aflatoxin B1 (AFB1) and fumonisin B1 (FMB1) are one of the biggest threats to food safety and often co-occur in cereals with possible synergistic toxic effects. Due to the climate change, it is predicted that mycotoxin-producing fungi will spread in their geographical distribution and consequently threaten food quality and availability to a whole new level. The aim of this study was to optimize and validate an in-house quantification method for AFB1 and FMB1 in cereals using wheat bran as a representative matrix for matrix-matched calibration. The method was based on ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) using the multiple reaction monitoring (MRM) technique for quantification. AFB1 and FMB1 were extracted with 70% acetonitrile containing 1% formic acid using horizontal shaking for 30 min. The purification was done using hexane and the QuEChERS method. The chromatographical separation of mycotoxins was performed in Acquity UPLC BEH C18 column and the detection was carried out with a quadrupole time-of-flight (QTOF) mass spectrometer. AFB1 showed a severe ion suppression (matrix effect: 20%) and FMB1 a slight ion enhancement (matrix effect: 108%) in the wheat bran matrix. These alterations of the ionization were successfully compensated by 13C-labeled internal standards and matrix-matched calibration. Quantification was performed by considering the peak area ratio and concentration ratio of the target analyte (AFB1 and FMB1) and its internal standard. Both AFB1 and FMB1 showed good linearity (R2 ≥ 0.995), high recoveries (89-92%) in spiking experiments and the low relative standard deviation within and between different days (3.3-6.9%). The method quantification limit was 1.0 ng/g for both mycotoxins. Uncertainty of the analysis for FMB1 in reference material was 644 ± 86 ng/g (k = 2, providing an approximate 95% confidence level when normal distribution was assumed). The validated LC-QTOF-MS method using wheat bran as a representative matrix fulfilled the performance criteria of Commission Regulation (EC) No 401/2006 and showed good performance for oat bran and maize flour.