Rare structural variants in severe spermatogenic impairment | Variantes estruturais raras na disfunção severa da espermatogénese

Mestrado em Biomedicina Molecular

A azoospermia afeta aproximadamente 15% de todos os homens inférteis e é frequentemente causada por anomalias cromossómicas e microdeleções do cromossoma Y. No entanto, em aproximadamente 70% dos casos de azoospermia não-obstrutiva (NOA) as causas permanecem por identificar. Nos últimos anos, a descoberta de variantes genómicas de número de cópia (CNVs), como as causadas por deleções, revelou uma fonte de variação genómica que afecta a dosagem génica e que poderá resultar em haploinsuficiência. De facto, observa-se uma sobre-representação de CNVs raros (<1% na população), sobretudo de grandes deleções de novo, em pacientes com diferentes distúrbios do desenvolvimento, comparados com controlos saudáveis. Porém, uma possível contribuição, para a infertilidade masculina, de variantes estruturais ligados ao cromossoma X e aos autossomas foi ainda pouco explorada. Este estudo foca-se na validação de deleções encontradas apenas em pacientes inférteis, no cromossoma X e em 11p13, que contêm genes candidatos a participar na espermatogénese. Estas deleções, previamente identificadas por arrays de oligonucleótidos, de elevada densidade (Affymetrix 6.0 SNP Array), numa coorte de 171 pacientes Portugueses com disfunção severa da espermatogénese (NOA e oligozoospermia severa), foram agora confirmadas por técnicas convencionais de genética molecular. Adicionalmente, a caraterização dos locais de quebra nestas deleções foi realizada por aCGH. Ainda que não se tenham validado as deleções menos extensas (em Xq21.1, Xq25, Xp11.4, Xq22.1 e Xq26.3), confirmou-se a nulizigotia em Xq28 nestes indivíduos, que abrange genes candidatos com uma função sugestiva na espermatogénese: MAGE-A8, expresso em testículo e em alguns cancros e o microRNA hsa-miR-4330, envolvido na regulação pós-transcricional de vários genes com expressão na linha germinal. Foi ainda validada, por MLPA, uma deleção extensa num paciente infértil não-sindrómico da nossa coorte. Estes resultados apontam a haploinsuficiência de WT1 como a causa mais provável de azoospermia neste paciente, já que não foram detetadas mutações germinais no alelo restante. Mutações no gene WT1, que codifica um factor de transcrição muito conservado, crucial para o desenvolvimento e manutenção gonadal em mamíferos, geralmente interferem com a ligação desta proteína ao DNA e estão principalmente associadas a síndromes que envolvem anomalias reprodutivas. Motivados pela nossa descoberta de uma deleção de WT1 num homem infértil embora saudável, decidimos abordar a contribuição de mutações exónicas no gene WT1 para a azoospermia isolada. Testámos a hipótese de que mutações localizadas em domínios que não aqueles essenciais à ligação ao DNA pudessem resultar na disfunção não-sindrómica da espermatogénese. Assim, analisámos a sequência codificante de WT1 num subgrupo de 40 pacientes azoospérmicos. Como resultado, descrevemos uma nova variação missense c.185C>T (P130L; ENST00000332351) no primeiro exão de WT1, inserida no domínio proteico de auto-associação. A nova variante descrita deverá ter um impacto menos drástico na função da proteína WT1, comparativamente com as mutações descritas no mesmo exão até à data, as quais resultam em proteínas truncadas e fenótipos severos de disfunção gonadal, incluindo a formação de tumores renais. Estes resultados revelam novos genes candidatos a um papel na espermatogénese e sugerem que a haploinsuficiência de proteínas importantes para o desenvolvimento do sistema reprodutor masculino podem resultar em azoospermia. Estudos futuros poderão clarificar a utilidade dos nossos genes candidatos como biomarcadores da infertilidade masculina. A implementação de novos biomarcadores beneficiaria os doentes azoospérmicos através da melhoria do diagnóstico, aconselhamento genético e acompanhamento destes pacientes, podendo vir a limitar a necessidade de procedimentos invasivos.

Azoospermia affects approximately 15% of all infertile males and it is frequently caused by chromosomal abnormalities and Yq microdeletions. However, despite considerable research efforts in the last decades, in approximately 70% of the cases of non-obstructive azoospermia (NOA) the causes are yet to be identified. In the last years, the discovery of genomic copy number variants, such as those caused by deletions, revealed a source of genomic variation which impacts gene dosage and may result in haploinsufficiency. In fact, rare CNVs (<1% population), mainly large de novo deletions, are over-represented in patients with different developmental disorders, compared to healthy controls. However, a possible contribution of X-linked and autosomal structural variants to male infertility is still largely unexplored. This study focused on the validation of rare patient-specific deletions found on the X chromosome and at 11p13 of infertile patients, which harbor candidate spermatogenesis genes. These deletions had been previously identified by high density oligonucleotide arrays (Affymetrix 6.0 SNP Array), in a cohort of 171 Portuguese patients with severe spermatogenic impairment (non-obstructive azoospermia and severe oligozoospermia) and were now confirmed by conventional molecular genetics techniques. Additionally, breakpoint characterization was carried out by aCGH. In fact, even though the smaller deletions (at Xq21.1, Xq25, Xp11.4, Xq22.1 and Xq26.3) were not validated, we confirmed nullizygosity at Xq28 in two patients, spanning either MAGE-A8, a known cancer-testis antigen, or hsa-miR-4330, a microRNA involved in post-transcription regulation, both with a suggestive role in spermatogenesis pathways. We have also validated by MLPA a large deletion at 11p13, in a non-syndromic infertile patient from our cohort. These results support WT1 haploinsufficiency as the likely cause of azoospermia in this patient, as no other germline mutations were detected in the remaining WT1 copy. Mutations in WT1, an evolutionarily conserved transcription factor crucial for gonadal development and maintenance in mammals, typically interfere with the DNA-binding properties of the protein and are mainly associated with syndromes involving reproductive abnormalities. Motivated by our finding of a WT1 deletion in an infertile but otherwise healthy man we addressed the contribution of WT1 exonic mutations to isolated azoospermia. We reasoned that mutations located in domains not essential for DNA binding could result in non-syndromic spermatogenic impairment. Thus, we analyzed the WT1 coding sequence in a subgroup of 40 azoospermic patients. As a result of the exon screening, we report a novel c.185C>T (P130L; ENST00000332351) WT1 missense variant on exon 1, within the protein self-association domain. While all exon 1 mutations as yet reported result in truncated proteins and severe phenotypes, including the formation of renal tumors, this novel variant is expected to have a milder impact on WT1 function. These results reveal new candidate genes for a role in spermatogenesis and suggest that haploinsufficiency of proteins important for the development of the male reproductive system can lead to azoospermia. Further studies will clarify the utility of our candidate genes as biomarkers of male infertility. The implementation of new biomarkers would benefit azoospermic men by improving diagnosis, genetic counseling and patient care, eventually limiting the need for invasive procedures.