Extended-spectrum β-lactamases and carbapenemases in Enterobacteriaceae of pets, wild animals, and humans. Are we facing a public health problem?

Background: Antibiotic resistance is considered a significant public health concern, caused by the use, overuse, and misuse of these drugs in clinic prescription and veterinary medicine. Specifically, Klebsiella pneumoniae is considered one of the major pathogenic bacteria associated with nosocomial infections. Commensal bacteria of the gastrointestinal tract, such as Escherichia coli, are a reservoir of resistance genes that can be transferred to other commensal or pathogenic bacteria. The Extended-Spectrum β-lactamase (ESBL)-producing E. coli and K. pneumoniae are considered one of the great concerns regarding the public health issue. This work aimed to understand the genetic mechanisms associated with ESBL-producing and carbapenem-resistant K. pneumoniae and E. coli isolates from pets, wildlife, and/or hospitalized patients. Materials and Methods: A total of 502 faecal samples were obtained from 361 dogs (127 healthy dogs and 234 sick dogs) and 141 cats (43 healthy cats and 98 sick cats). All samples were collected between April-August 2017 using standardized procedures and one sample/animal. The samples from sick animals were obtained from hospitalized pets in seven hospitals/clinic centers located in different cities of Portuguese territory; faecal samples from healthy animals were recovered by their owners. These samples were processed in MacConkey agar supplemented with 2µg/mL cefotaxime (CTX) or 0.8µg/mL meropenem (MRP) for cefotaxime-resistant (CTXR ) or carbapenem-resistant (CPR ) E. coli or K. pneumoniae isolates in pets, respectively. Moreover, faecal samples were collected from 22 healthy free-ranging (wild) vulture chicks from Lanzarote and Fuerteventura (Canary Islands) during July 2019; they were seeded in MacConkey agar supplemented with cefotaxime (2 μg/ml). A total of 58 fecal samples were also recovered from apparently healthy camels used in touristic activities from Gran Canaria (n=32) and Fuerteventura (n=26) Islands during the same period. On the other hand, 84 cefotaxime/ceftazidime-resistant K. pneumoniae and E. coli isolates were obtained from different clinical samples (blood, urine, bronchial secretion, pus, among others) in a Northern Portuguese hospital (Centro Hospitalar de Trás os Montes e Alto Douro, CHTMAD). The MALDI-TOF-MS method was used for E. coli and K. pneumoniae identification, and antimicrobial susceptibility was performed by disk diffusion test, according to CLSI (2019) guidelines. Detection of β-lactamases and other antibiotic resistance genes, phylogenetic grouping, and molecular typing MLST (for selected isolates) were performed by specific PCR and sequencing. Results: K. pneumoniae isolates were recovered from MacConkey agar supplemented with MRP in 16 of the 361 tested dogs (4.4%, 13 from sick dogs and 3 from house healthy dogs) and one isolate/sample was characterized. Three of these isolates showed diminished susceptibility/resistance to carbapenems but carbapenemase genes were not detected; 15 of these 16 isolates were ESBL-producers (93.8%) and they carried the genes encoding CTX-M15 and/or SHV-28, associated in some cases with the high-risk clones ST307 and ST15. Fortyseven ESBL-producing E. coli isolates were detected among the 51 CTXR isolates (92.2%), recovered from 32 sick and 15 healthy dogs (frequencies of 13.7% and 11.8%, respectively). Different variants of blaCTX-M genes were detected among 45 of 47 ESBL-producers: blaCTX-M15 (n=26), blaCTX-M-1 (n=10), blaCTX-M-32 (n=3), blaCTX-M-55 (n=3), blaCTX-M-14 (n=2) and blaCTXM-variant (n=1). Although at a lower rate, the CMY-2 β-lactamase was also found among one ESBL-positive isolate (co-produced CTX-M-15) and 2 additional CTXR ESBL-negative canine E. coli isolates. Ten different sequences types were identified among dog isolates (ST/phylogenetic-group/β-lactamase): ST131/B2/CTX-M-15, ST617/A/CTX-M-55, ST3078/B1/CTX-M-32, ST542/A/CTX-M-14, ST57/D/CTX-M-1, ST12/B2/CTX-M-15, ST6448/B1/CTX-M-15+CMY-2, ST5766/A/CTX-M-32, ST115/D/CMY-2 and a newST/D/CMY-2. On the other hand, qAmpC (CMY-2) (n=3, 2.1%)- and ESBL (n=11, 7.8%)-producing E. coli isolates were obtained from healthy and sick cats. However, K. pneumoniae was not recovered among the cats’ samples. E. coli isolates carried the following ESBL genes: blaCTXM-1 (n = 3), blaCTX-M-15 (n = 3), blaCTX-M-55 (n = 2), blaCTX-M-27 (n = 2) and blaCTX-M-9 (n = 1). Six different sequence types were identified among cat ESBL-producers (sequence type/associated ESBLs): ST847/CTX-M-9, CTX-M-27, CTX-M-1; ST10/CTX-M-15, CTX-M-27; ST6448/CTX-M-15, CTX-M-55; ST429/CTXM-15; ST101/CTX-M-1 and ST40/CTX-M-1. Three of the CTXR isolates were CMY-2-producers (two of them were ESBL-positive and one ESBL-negative), typed as ST429 and ST6448, and obtained in healthy or sick cats. The phylogenetic groups A/B1/D/clade 1 were detected among ESBL- and qAmpC-producing isolates of cat origin. Regarding the 22 CTXR K. pneumoniae isolates obtained from blood cultures, ESBL activity was detected in 54% of the isolates, and it was associated with CTX-M-15 and/or a SHV-type (blaSHV-27 or blaSHV-106 variants). Fourteen K. pneumoniae isolates showed imipenem resistance and 11 of them carried the KPC2/3 (carbapenemase gene). Four different genetic lineages were found among K. pneumoniae of blood origin: ST348, ST11, ST147, and ST15. ESBL activity was detected in all 62 E. coli and K. pneumoniae clinical isolates from different origins, other than blood. Considering the 24 ESBL-producing K. pneumoniae isolates, 18 of them carried a blaCTX-M gene (blaCTX-M-15 or blaCTX-M-55) and 14 carried an ESBL of SHVtype (blaSHV-12 or blaSHV-27). Ten K. pneumoniae isolates carried the blaKPC2/3 gene (always associated with ESBL genes) and showed imipenem-resistance. The K. pneumoniae genomic population structure was dominated by three international lineages: ST15, ST147, and ST280. Furthermore, the 38 ESBL-positive E. coli isolates obtained from different clinical origins carried in the majority of cases the blaCTX-M-15 gene (84%), ascribed to B2 phylogenetic group (84%), mostly associated with ST131 lineage and, at a lower rate, to ST410/A. Camels from the Canary Islands can be a source of ESBL-producer bacteria (3.8%), containing the widespread blaCTX-M-15 gene and belong to the lineages ST3018 (phylogroup A) and ST69 (phylogroup B1). Similarly, ESBL-producing E. coli isolates were detected in 22.7% of the wild vultures tested, carrying blaCTX-M genes (blaCTX-M-15 and blaCTX-M-55). These vulture isolates were ascribed to the following genetic lineages (ST/phylogenetic group/ESBL): ST515/B1/CTX-M-15, ST1290/A/CTX-M-15, ST38/D/CTX-M-15, ST457/D/CTX-M-55, and ST6448/B1/CTX-M-55. Conclusions: To our knowledge, this is the first study involving a complete approach to β-lactamases-producing Enterobacteriaceae among sick and healthy pets from Portugal, as well as Portuguese clinical isolates and wild animals from the Canary Islands. These isolates are associated with different international clones in which CTX-M-15 is the most frequent βlactamase in all studied ecosystems, also highlighting the KPC2/3 gene in Portuguese clinical isolates. These findings might represent a public health problem due to the proximity of pets (dogs and cats) with humans from a One Health perspective.

Introdução: A resistência aos antibióticos é considerada uma problemática de saúde pública, provocada pelo uso excessivo ou incorreto deste tipo de medicamentos em medicina humana e veterinária. As bactérias comensais do trato gastrointestinal, como Escherichia coli, são um reservatório de genes de resistência a antibióticos que podem ser transferidos para outras bactérias, quer comensais quer patogénicas, sendo Klebsiella pneumoniae considerada uma das principais bactérias patogénicas associadas às infeções nosocomiais. Escherichia coli e K. pneumoniae produtoras de β-lactamases de espectro estendido (ESBL) são consideradas uma das maiores preocupações em saúde pública. Este trabalho tem como objetivo compreender os mecanismos genéticos associados aos isolados de K. pneumoniae e E. coli produtores de ESBL e carbapenemos em animais de estimação, animais selvagens e humanos hospitalizados. Materiais e Métodos: Um total de 502 amostras fecais foram obtidas de 361 cães (127 cães saudáveis e 234 cães doentes) e 141 gatos (43 gatos saudáveis e 98 gatos doentes). Todas as amostras foram recolhidas entre abril e agosto de 2017, obtendo-se uma amostra / animal. As amostras de animais doentes foram obtidas a partir de animais de estimação hospitalizados em sete hospitais/centros clínicos localizados em diferentes cidades do território português; as amostras fecais de animais saudáveis foram recolhidas pelos seus donos. Estas amostras foram processadas em agar MacConkey suplementado com 2µg / mL de cefotaxima (CTX) ou 0,8µg / mL de meropenemo (MRP) para isolados de E. coli resistentes a cefotaxima (CTXR ) e isolados de K. pneumoniae resistentes a carbapenemos (CPR ) em animais de estimação, respetivamente. Além disso, foram recolhidas amostras fecais de 22 crias de abutres saudáveis em Lanzarote e Fuerteventura (Ilhas Canárias) durante o mês de julho de 2019; estas amostras foram semeadas em agar MacConkey suplementado com cefotaxima (2 μg / ml). Um total de 58 amostras fecais foram obtidas de camelos aparentemente saudáveis usados em atividades turísticas nas ilhas de Gran Canaria (n = 32) e Fuerteventura (n = 26) durante o mesmo período. Por outro lado, 84 isolados de K. pneumoniae e E. coli resistentes a cefotaxima / ceftazidima foram obtidos de diferentes amostras clínicas humanas (sangue, urina, secreção brônquica, pus, entre outros) num hospital localizado no Norte de Portugal (Centro Hospitalar de Trás os Montes e Alto Douro, CHTMAD, Vila Real). O método MALDI-TOF-MS foi utilizado para a identificação de E. coli e K. pneumoniae, e o teste de sensibilidade antimicrobiana foi realizado por disco-difusão, de acordo com as indicações do CLSI (2019). A deteção de β-lactamases e outros genes de resistência a antibióticos, grupos filogenéticos e estudo molecular MLST (para isolados selecionados) foram realizados por PCR / sequenciação específicos. Resultados: Os isolados de K. pneumoniae foram obtidos a partir do agar MacConkey suplementado com MRP em 16 dos 361 cães analisados (4,4%, 13 de cães doentes e 3 de cães saudáveis) e um isolado/amostra foi caracterizado posteriormente. Três desses isolados mostraram reduzida suscetibilidade/ resistência a carbapenemos, apesar de não terem sido detetados genes de carbapenemases; 15 desses 16 isolados eram produtores de ESBL (93,8%) e possuíam os genes codificadores CTX-M-15 e / ou SHV-28, associados em alguns casos aos clones de alto risco ST307 e ST15. Quarenta e sete isolados de E. coli produtoras de ESBL foram detetados entre os 51 isolados de CTXR (92,2%), obtidos de 32 cães doentes e 15 cães saudáveis (frequências de 13,7% e 11,8%, respetivamente). Foram ainda detetadas diferentes variantes do gene blaCTX-M entre os 45/47 produtores de ESBL: blaCTX-M-15 (n = 26), blaCTX-M-1 (n = 10), blaCTX-M-32 (n = 3), blaCTX-M-55 (n = 3), blaCTX-M-14 (n = 2) e blaCTX-M-variante (n = 1). Embora menos frequente, a β-lactamase CMY-2 também foi encontrada num isolado ESBLpositivo (associado ao gene CTX-M-15) e em 2 isolados adicionais de E. coli de origem canina (CTXR ESBL-negativo). Foram identificados dez tipos de sequências diferentes nos isolados de cães (ST / grupo filogenético / β-lactamase): ST131 / B2 / CTX-M-15, ST617 / A / CTX-M55, ST3078 / B1 / CTX-M-32 , ST542 / A / CTX-M-14, ST57 / D / CTX-M-1, ST12 / B2 / CTX-M-15, ST6448 / B1 / CTX-M-15 + CMY-2, ST5766 / A / CTX -M-32, ST115 / D / CMY2 e um novo-ST / D / CMY-2. Por outro lado, os isolados de E. coli produtoras de qAmpC (CMY-2) (n = 3, 2,1%) e ESBL (n = 11, 7,8%) foram obtidos de gatos saudáveis e doentes. No entanto, K. pneumoniae não estava presente nas amostras analisadas de gatos. Os isolados de E. coli possuíam os seguintes genes ESBL: blaCTX-M-1 (n = 3), blaCTX-M-15 (n = 3), blaCTX-M-55 (n = 2), blaCTX-M-27 (n = 2) e blaCTX-M-9 (n = 1). Além disso, foram identificados seis tipos de sequências diferentes nos produtores de ESBL em gatos (tipo de sequência / ESBL associado): ST847 / CTX-M-9, CTXM-27, CTX-M-1; ST10 / CTX-M-15, CTX-M-27; ST6448 / CTX-M-15, CTX-M-55; ST429 / CTXM-15; ST101 / CTX-M-1 e ST40 / CTX-M-1. Três dos isolados de CTXR eram produtores de CMY-2 (dois deles eram ESBL-positivos e um ESBL-negativo), tipificados como ST429 e ST6448, e obtidos em gatos saudáveis ou doentes. Os grupos filogenéticos A / B1 / D / clade 1 foram detetados entre isolados produtores de ESBL e qAmpC de origem felina. Em relação aos 22 isolados de K. pneumoniae CTXR obtidos a partir de hemoculturas, a atividade de ESBL foi detetada em 54% dos isolados e estava associada à presença dos genes CTX-M-15 e / ou tipo SHV (blaSHV-27 ou blaSHV-106 variantes). Catorze isolados de K. pneumoniae apresentaram resistência ao imipenemo e 11 deles possuíam o gene KPC2/3. Um total de quatro linhagens genéticas diferentes foram encontradas nos isolados de K. pneumoniae de origem sanguínea: ST348, ST11, ST147 e ST15. A atividade de ESBL foi detectada em todos os 62 isolados clínicos de E. coli e K. pneumoniae de diferentes origens, exceto em sangue. Considerando os 24 isolados de K. pneumoniae produtores de ESBL, 18 deles possuíam o gene blaCTX-M (blaCTX-M-15 ou blaCTX-M55) e 14 eram positivos para um tipo de SHV (blaSHV-12 ou blaSHV-27). Dez isolados de K. pneumoniae possuíam o gene blaKPC2/3 (sempre associado a genes ESBL) e apresentavam resistência ao imipenemo. A população genómica de K. pneumoniae foi dominada por três linhagens internacionais: ST15, ST147 e ST280. Além disso, os 38 isolados de E. coli produtores de ESBL obtidos de diferentes origens clínicas eram positivos para o gene blaCTXM-15 (84%), atribuído ao grupo filogenético B2 (84%), principalmente associado à linhagem ST131 e, em menor prevalência, a ST410 / A. Os camelos das Ilhas Canárias podem ser considerados reservatórios de bactérias produtoras de ESBL (3,8%), contendo o gene blaCTX-M-15 amplamente disseminado e associado às linhagens ST3018 (filogrupo A) e ST69 (filogrupo B1). Da mesma forma, os isolados de E. coli produtores de ESBL foram detetados em 22,7% dos abutres selvagens testados, sendo portadores do gene blaCTX-M (blaCTX-M-15 e blaCTX-M-55). Estes isolados de abutres foram classificados com as seguintes linhagens genéticas (ST / grupo filogenético / ESBL): ST515 / B1 / CTX-M-15, ST1290 / A / CTX-M-15, ST38 / D / CTX-M-15, ST457 / D / CTX-M-55 e ST6448 / B1 / CTX-M-55. Conclusões: Este é o primeiro estudo que envolve uma abordagem completa de Enterobacteriaceae produtoras de β-lactamases em animais domésticos saudáveis e doentes de Portugal, bem como em isolados clínicos humanos portugueses, e também em animais selvagens das Ilhas Canárias. Estes isolados estão associados a diferentes clones internacionais nos quais CTX-M-15 é a β-lactamase mais frequente em todos os ecossistemas estudados, destacando-se também o gene KPC2/3 em isolados clínicos humanos portugueses. Estes resultados promissores podem representar um problema de saúde pública devido à proximidade de animais de estimação (cães e gatos) com humanos do ponto de vista da One Health (uma só Saúde).