Estudo das doenças genéticas humanas na vertente técnica e científica: citogenética convencional e molecular- FISH

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial apresentada à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

A descoberta da estrutura e número correto dos cromossomas humanos permitiu a associação de diversas anomalias cromossómicas como a causa de doenças genéticas, tendo por isso um grande impacto na saúde pública. Esta associação permitiu o desenvolvimento da citogenética clínica, que tem como principal objetivo o diagnóstico das anomalias cromossómicas. Para tal, foram desenvolvidas técnicas de cultura celular e de bandeamento permitindo a análise e identificação dos cromossomas. Porém, estas práticas apresentam limitações, sendo necessário desenvolver técnicas com resoluções superiores de modo a complementar e colmatar dúvidas na interpretação da análise cromossómica. Assim o estudo citogenético inclui a metodologia convencional para a obtenção de um cariotipo, bem como técnicas de citogenética molecular como a Fluorescence in Situ Hybridization (FISH), o Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) e o array Comparative Genomic Hybridization (aCGH), entre outras, que permitem análises mais direcionadas e/ou a deteção de anomalias de menores dimensões. O estudo citogenético pode ser realizado em contexto de diagnóstico pré e pósnatal. Com o aumento da realização de estudos citogenéticos e a utilização de técnicas mais específicas, têm-se descoberto rearranjos cromossómicos complexos de difícil deteção e que apresentam fenótipos com grande variabilidade. Deste modo, é de extrema importância caracterizar eventuais desequilíbrios cromossómicos e determinar a sensibilidade, especificidade e contributo das diferentes técnicas de diagnóstico citogenético na deteção de anomalias cromossómicas. Com este estudo pretendeu-se obter um melhor conhecimento das diferentes anomalias detetadas, no Centro de Genética Médica Jacinto de Magalhães. E efetuar a divulgação dos resultados junto da comunidade científica, assim como avaliar as limitações e vantagens das diferentes técnicas citogenéticas, de modo a poder estabelecer uma melhor correlação entre a anomalia e o fenótipo apresentado e ajudar a estabelecer um diagnóstico mais rápido e eficaz. Durante este estudo foram identificados 10 casos de interesse, que incluem uma duplicação de genes do cromossoma Y, uma duplicação de um gene do cromossoma 5, um isocromossoma X, um derivativo do cromossoma X, um cromossoma marcador supranumerário do cromossoma 15, um derivativo do cromossoma 2, um mosaico 45,X/46,idic(Y), um cromossoma Y dicêntrico, uma deleção subtelomérica do braço curto do cromossoma 3 e uma Síndrome de Cri-du-Chat. As técnicas utilizadas neste trabalho foram fundamentais para o estudo de pacientes com fenótipos particulares e nos casos que apresentam rearranjos mais complexos, a combinação das diferentes técnicas foi essencial para obter o diagnóstico correto. Na maioria dos casos foi estabelecida a correlação genótipo-fenótipo para as anomalias cromossómicas identificadas, todavia, não foi possível estabelecer esta correlação em alguns dos casos reportados, sendo necessário recomendar a realização de estudos posteriores.

The discovery of the structure and correct number of the human chromosomes has allowed the association between several chromosomal abnormalities as the cause of genetic diseases, thus having a major impact on public health. This association enabled the development of clinical cytogenetics, whose main objective is the diagnosis of chromosomal abnormalities. Cell culture and banding techniques were thus developed allowing the analysis and identification of chromosomes. However, these techniques have limitations, and their development with higher resolution in order to complement and rectify this initial techniques proved to be necessary. Therefore, the constitutional cytogenetic study includes the conventional methodology for obtaining a karyotype, as well as molecular cytogenetics techniques such as Fluorescence in Situ Hybridization (FISH), Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) and array Comparative Genomic Hybridization (aCGH),that permit a targeted analysis and the detection of minor anomalies. The cytogenetic study can be performed in the context of pre- and post-natal diagnosis. With the increase in the performance of cytogenetic studies and the use of more specific techniques, complex chromosomal rearrangements that are difficult to detect and present with highly variable phenotypes have been discovered. Since then it became extremely important to characterize these chromosomal disorders and to determine the sensitivity, specificity and contribution of different cytogenetic diagnostic techniques in the detection of chromosomal anomalies. This study aimed to obtain a better knowledge of the different anomalies detected, at the Centro de Genética Médica Jacinto de Magalhães and carry out the dissemination of the results to the scientific community, as well as assess the limitations and advantages of the different cytogenetic techniques, in order to be able to establish a better correlation between the anomaly and the presented phenotype and help to establish a faster and more effective diagnosis. During this study, 10 cases of interest were identified, which include an duplication of Y chromosome genes, a genetic amplification of chromosome 5, an X isochromosome, a derivative chromosome X, a supernumerary marker of chromosome 15, a derevitive chromosome 2, a 45,X/46,idic(Y) mosaicism, a dicentric Y chromosome, a subtelomeric deletion of 3p region, and a Cri-du-chat syndrome. The techniques used in this work were fundamental in the study of patients with particular phenotypes, in cases with more complex rearrangements the combination of different techniques was essential to obtain the correct diagnosis. In most cases, the genotype-phenotype correlation was established according to the chromosomal abnormalities. However, it was not possible to establish this correlation in some of the reported cases, thus the need to proceed to further genetic studies was recommended.