Multibiomarker assessment of cadmium-based quantum dots effects in the marine mussel Mytilus galloprovincialis

Tese de Doutoramento, Ciências do Mar, da Terra e do Ambiente, Ramo: Ciências e Tecnologias do Ambiente, Especialização em Ecotoxicologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016

Nanotechnology and use of engineered nanomaterials (ENMs) may improve life quality, economic growth and environmental quality, but their environmental risk in the marine environment is scarce. Properties of quantum dots (QDs), namely small size, unique optical and biofunctional properties, allow their use in nanomedicine, biology and electronics, but also confer different toxicity compared to its dissolved counterparts. Accordingly, this thesis assessed the toxicokinetics (TK), mode of action (MoA) and toxicity of CdTe QDs (10 μg Cd L-1) in the marine mussel Mytilus galloprovincialis, compared to dissolved Cd for 21 days followed by 50 days depuration. For this purpose, Cd distribution in different mussel tissues, subcellular fractions and biodeposits were analysed, TK parameters estimated (accumulation and elimination rates, bioconcentration factor and half-life time) and multibiomarkers assessed: immunotoxicity (density, viability and differential cell count of hemocytes), cytotoxicity (lysosomal membrane stability - LMS), genotoxicity (DNA damage and nuclear anomalies), oxidative stress (superoxide dismutase - SOD, catalase - CAT, glutathione peroxidase - GPx and glutatione-S-Transferase - GST), metal exposure (metallothionein - MT), oxidative damage (lipid peroxidation - LPO), tissue-level biomarkers (17 histomorphometric parameters of digestive tubules, inflammatory and histopathological conditions indices) and proteomic responses. Results showed that the digestive gland plays an important role in storage, metabolism and detoxification of QDs, while gills have similar functions for dissolved Cd and the hemolymph in transport, distribution and regulation of QDs. Tissue specific metabolism patterns and nano-specific effects were identified, wherein the MoA and toxicity of QDs in mussels is time dependent and involve oxidative stress, immune response, DNA damage and differential protein expression. Mussels were unable to completely eliminate the QDs (t1/2 > 50 days), highlighting their potential source of toxicity for human health and environment. M. galloprovincialis is a significant target of QDs ecotoxicity and represent a suitable biomonitor for assess their environment risk.

A nanotecnologia e o uso de nanomateriais manufaturados (NMs) podem melhorar a qualidade de vida, o crescimento económico e a qualidade ambiental. Contudo, o rápido desenvolvimento e uso dos NMs em vários produtos levantam preocupações sobre a sua libertação no ambiente, em especial em águas residuais e no ambiente marinho, ao mesmo tempo em que o conhecimento sobre seu risco ambiental permanece escasso. Dentre os NMs, os pontos quânticos (“quantum dots” - QDs) são nanocristais semicondutores com ampla aplicação na nanomedicina, biologia e eletrónica devido às suas propriedades físico-químicas, tais como tamanho (1 - 10 nm), propriedades ópticas e eletrónicas e capacidade de bioconjugação. Entretanto, as propriedades nano-específicas dos QDs podem também induzir toxicidade diferente da comparada com a sua contraparte dissolvida. Por conseguinte, esta dissertação avaliou a toxicocinética (TK), o modo de ação (MoA) e a toxicidade dos CdTe QDs no mexilhão marinho Mytilus galloprovincialis, em comparação com o Cd dissolvido. Inicialmente, as características dos QDs, seu comportamento e destino na água do mar foram analisados em termos de forma, tamanho, diâmetro hidrodinâmico, carga superficial (potencial zeta), índice de poli-dispersão, ponto isoelétrico, cinética de agregação/aglomeração, estabilização com diferentes tipos matéria orgânica natural (NOM), taxa de sedimentação e taxa de dissolução. Para análise da toxicocinética dos QDs em comparação com sua parte dissolvida, os mexilhões M. galloprovincialis foram expostos (a uma mesma concentração ambientalmente relevante de Cd, 10 μg Cd L-1) a QDs e a Cd dissolvido durante 21 dias, seguido de um período de depuração de 50 dias, juntamente com um grupo controlo. A cinética de acumulação e eliminação do Cd foi analisada em diferentes tecidos (brânquias, glândula digestiva, hemolinfa e resto), frações subcelulares (fração insolúvel, fração das proteínas de elevado peso molecular e fração das proteínas de baixo peso molecular) e biodepósitos dos mexilhões (fezes e pseudofezes) por espectrometria de absorção atómica com forno de grafite, seguido da estimativa dos parâmetros toxicocinéticos (taxas de acumulação e eliminação, fator de bioconcentração e tempo de meia-vida - t1/2). Para o estudo comparativo do MoA e toxicidade dos QDs e sua contraparte dissolvida, os mexilhões foram expostos a QDs e a Cd dissolvido (10 μg Cd L-1) durante 14 dias e uma bateria de biomarcadores foi analisada: imunotoxicidade (densidade, viabilidade e contagem diferencial de hemócitos), citotoxicidade (estabilidade da membrana lisossomal - LMS), genotoxicidade (danos no ADN e anomalias nucleares), estresse oxidativo (superóxido dismutase - SOD, catalase - CAT, glutationa peroxidase - GPx e glutationa-Stransferase - GST), exposição a Cd (metalotioneína - MT), dano oxidativo (peroxidação lipídica - LPO) e biomarcadores a nível tecidual (17 parâmetros histomorfométricos dos túbulos digestivos, condição inflamatória e os índices de condição histopatológica). Além disso, um estudo exploratório para identificar possíveis novos biomarcadores foi realizado na glândula digestiva dos mexilhões expostos a ambas formas de Cd (QDs e Cd dissolvido) (10 μgCd L-1) durante 14 dias através de análise proteómica. Os CdTe QDs usados neste estudo foram nanopartículas esferóides cobertas com grupos carboxílicos (-COOH) e com tamanho primário de 6 ± 1 nm. Em água do mar, os QDs tendem a formar agregados/aglomerados com diâmetro hidrodinâmico de 1014 ± 187 nm e carga superficial negativa (potencial zeta = -9.4 ± 1.2 mV), reduzindo a sua área superficial total em contato com o meio circundante. A taxa de dissolução dos QDs na água do mar foi de 27.6 % e a sua taxa de sedimentação rápida e lenta foi de 0.88 ± 5 x 10-4 e 0.009 ± 8.45 x 10-4, respectivamente, confirmando a sua tendência de agregar/aglomerar e sedimentar nos tanques de exposição, enquanto a estabilização com diferentes tipos de NOM (ácidos húmicos, ácido tânico, ácido salicílico) não foi observada. Uma visão geral dos resultados indica que a especiação do Cd na água do mar durante a exposição dos mexilhões aos CdTe QDs corresponde a 72 % são pequenos e grandes homo-agregados de QDs, 27.6 % são Cd iónico livre (Cd2+) e complexos orgânicos e/ou inorgânicos de Cd devido à libertação de Cd dissolvido dos QDs. Ambas as formas de Cd estão disponíveis para o mexilhão M. galloprovincialis e são acumuladas dependendo dos tecidos e tempo de exposição. Detectaram-se uma distribuição tecidual semelhante nos mexilhões expostos aos QDs e ao Cd dissolvido (glândula digestiva > brânquias > resto > hemolinfa), mas a cinética de acumulação foi dependente da forma de Cd. Nos mexilhões expostos aos QDs, foi detectada uma acumulação de Cd nas frações contendo mitocôndrias, núcleo e lisossomas, indicando potenciais alvos sub-celulares para a toxicidade dos QDs. Embora os níveis de MTs estejam diretamente associados com ambas as formas de Cd, a distribuição subcelular dos QDs está relacionada ao metal na sua forma biologicamente ativa (BAM), mas sem indução de LPO, enquanto que o Cd dissolvido foi detectado na forma biologicamente detoxificado (BDM), indicando efeitos nano específicos. Os resultados mostraram ainda que a glândula digestiva desempenha um papel fundamental no armazenamento, metabolismo e desintoxicação dos QDs, enquanto as brânquias têm funções semelhantes nos mexilhões expostos ao Cd dissolvido e a hemolinfa atua no transporte, distribuição e regulação dos QDs. Padrões específicos de metabolismo foram observados para ambas as formas de Cd de acordo com os tecidos analisados. O MoA e a toxicidade dos QDs nos mexilhões são dependentes do tecido e do tempo de exposição e envolvem mudanças na atividade das enzimas antioxidantes, estress oxidativo, resposta imune e danos no ADN. As brânquias são o principal órgão afetado pelo estress oxidativo induzido pelos QDs com efeitos associados ao aumento da atividade da SOD, GST e GPx, enquanto que os efeitos do Cd dissolvido estão relacionados com o aumento da atividade da CAT. Os efeitos dos QDs nos mexilhões classificam-se como imunocitotóxicos e genotóxico, mas não citogenotóxicos. A imunotoxicidade dos QDs nos mexilhões é mediada pela redução da LMS, mudanças na frequência dos tipos de hemócitos e danos no ADN, enquanto os efeitos na densidade e viabilidade dos hemócitos e alterações cromossómicas não foram observados, em oposição aos efeitos observados para o Cd dissolvido. Os resultados da análise proteómica indicam que os QDs e o Cd dissolvido induzem mudanças na expressão de proteínas na glândula digestiva dos mexilhões de modo dependente da forma de Cd. Foram observadas diferenças significativas (≥ 2 vezes) em 304 proteínas entre os mexilhões expostos a ambas as formas de Cd e aos não expostos, em que 32 e 123 proteínas são específicas para os QDs e o Cd dissolvido, respectivamente, enquanto alterações em 28 proteínas foram observadas somente após a exposição a ambas as formas de Cd. Esses resultados indicam que o MoA e a toxicidade dos QDs não são devidos somente à dissolução dos QDs e libertação de Cd dissolvido (Cd2+), mas também estão relacionados com as suas propriedades nano específicas. Durante o período de depuração, as brânquias dos mexilhões possuem baixa capacidade de eliminação dos QDs, enquanto a glândula digestiva é o principal órgão de acumulação, metabolismo e eliminação de ambas as formas de Cd. Os mexilhões não foram capazes de eliminar completamente os QDs acumulados (t1/2 > 50 dias), destacando a sua fonte potencial de toxicidade para a saúde humana e ambiental. Além disso, o mexilhão marinho M. galloprovincialis é alvo significativo da ecotoxicidade dos QDs e representa um biomonitor adequado para avaliar o seu risco ambiental.

National Council for Scientific and Technological Development (CNPq), the Brazil's Science Without Borders Program