Optimization of killer assays for yeast selection protocols Optimización de la actividad killer para protocolos de selección de levaduras

A new optimized semiquantitative yeast killer assay is reported for the first time. The killer activity of 36 yeast isolates belonging to three species, namely, Metschnikowia pulcherrima, Wickerhamomyces anomala and Torulaspora delbrueckii, was tested with a view to potentially using these yeasts as biocontrol agents against the wine spoilage species Pichia guilliermondii and Pichia membranifaciens. The effectiveness of the classical streak-based (qualitative method) and the new semiquantitative techniques was compared. The percentage of yeasts showing killer activity was found to be higher by the semiquantitative technique (60%) than by the qualitative method (45%). In all cases, the addition of 1% NaCl into the medium allowed a better observation of the killer phenomenon. Important differences were observed in the killer capacity of different isolates belonging to a same killer species. The broadest spectrum of action was detected in isolates of W. anomala NPCC 1023 and 1025, and M. pulcherrima NPCC 1009 and 1013. We also brought experimental evidence supporting the importance of the adequate selection of the sensitive isolate to be used in killer evaluation. The new semiquantitative method proposed in this work enables to visualize the relationship between the number of yeasts tested and the growth of the inhibition halo (specific productivity). Hence, this experimental approach could become an interesting tool to be taken into account for killer yeast selection protocols.<br>En este trabajo se presenta un nuevo ensayo semicuantitativo que optimiza la detección de actividad killer en levaduras. Se evaluó la actividad killer de 36 cepas pertenecientes a las especies Metschnikowia pulcherrima, Wickerhamomyces anomala y Torulaspora delbrueckii, en vista del potencial uso de estas levaduras como agentes de biocontrol frente a las especies contaminantes de vinos Pichia guilliermondii y Pichia membranifaciens. Se comparó la efectividad de la técnica clásica basada en estrías (método cualitativo) con la del nuevo método semicuantitativo. El porcentaje de levaduras que mostraron actividad killer fue más alto cuando se utilizó el método semicuantitativo (60%) que con el método cualitativo (45%). En todos los casos, el agregado de 1% de NaCl en el medio permitió una mejor observación del fenómeno killer. Se observaron importantes diferencias en la capacidad killer de diferentes cepas dentro de la misma especie. Se detectaron dos cepas de W. anomala (NPCC 1023 y 1025) y dos cepas de M. pulcherrima (NPCC 1009 y 1013) con un amplio espectro de acción, ya que fueron capaces de inhibir el desarrollo de las tres levaduras sensibles evaluadas. La evidencia experimental demuestra la importancia de una adecuada selección de la cepa sensible al evaluar la actividad killer. El nuevo método semicuantitativo propuesto en este trabajo permite visualizar la relación entre el número de levaduras sembradas y el halo de inhibición del crecimiento (productividad específica). En conclusión, este método resulta una herramienta interesante para ser tenida en cuenta en los protocolos de selección de levaduras killer.