Nephrotoxicity of Bence-Jones proteins: correlation with endocytosis by BHK cells and intracellular movement

The aim of this investigation was to evaluate the endocytosis of two Bence-Jones proteins by renal cells in order to elucidate the interference of their physical and chemical characteristics on nephrotoxicity. Bence-Jones proteins (AK and GL) were purified and isolated from the urine of two patients with multiple myeloma. The isotype of both proteins was characterised as being human monoclonal lambda light chain. The AK protein presented mainly an Ip>7.0, a high content of galactose and a low amount of sialic acid molecules. On the other hand, the GL protein presented a single band with an Ip of 4.3, a higher level of sialic acid and a reduced amount of galactose, in comparison with the AK protein. Baby Hamster Kidney (BHK) cells were maintained in culture in bottles at 37ºC, using DMEM culture media supplemented with 10% of calf serum with a pH of 7.4. Once the monolayer was observed to be confluent, the BHK cells were incubated with the two proteins, dissolved in a serum-free medium for 1, 5, 15, 30, 60 minutes and 24 hours. Control cells were established omitting the incubation with Bence-Jones proteins, but maintaining all of the other conditions. After, this the cells were washed, trypsinised, centrifuged and fixed in a solution of 4% paraformaldehyde and 0.5% glutaraldehyde on a 0.1 M, pH 7.4 phosphate buffer. Cells were processed for immunocytochemical reactions by using protein A coupled with colloidal gold and further silver enhancement. Semi-thin sections of the pellets were obtained and submitted to the cytochemical reactions. Detection of labelling was made by using light microscopy. It was observed that GL protein tended to be directed towards a perinuclear position, whereas the AK protein tended to suffer lysosomal deviation, suggesting that there is a direct contribution of physical and chemical characteristics on intracellular direction taken by Bence-Jones proteins.<br>O objetivo deste trabalho foi avaliar a endocitose de duas proteínas de Bence Jones por células renais, com a finalidade de elucidar a interferência de características físico-químicas na nefrotoxicidade. As proteínas de Bence Jones (denominadas AK e GL) forma purificadas e isoladas da urina de dois pacientes com mieloma múltiplo. Isótopos de ambas as proteínas foram caracterizdos como sendo cadeias leves lambda monoclonais humanas. AK apresentou principalmente pI > 7,0, alto conteúdo de galactose e baixo teor de moléculas de ácido siálico. Por outro lado, GL apresentou uma única banda com pI 4,3, maior teor de ácido siálico e baixo teor de galactose, em comparação com AK. Células renais de hamster, BHK (Baby Hamster Kidney) foram mantidas em cultura à temperatura de 37ºC, utilizando meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, em pH 7,4. Quando confluentes, as céluals BHK foram incubadas com as duas proteínas dissolvidas em meio isento de soro, durante 1, 5, 15, 30, 60 minutos e 24 horas. Foi omitida a incubação com proteínas de Bence Jones em células usadas como controle. Com o término da incubação, as células foram lavadas, tripsinizadas, centrifugadas e fixadas em solução de paraformaldeído 4,0% e glutaraldeído 0,5% em tampão fosfato 0,1M pH 7,4. A seguir, os pellets obtidos foram processados para microscopia e incluídos em LRWhite. Cortes semi-finos foram colhidos e submetidos a reações imunocitoquímicas, utilizando proteína A-acoplada a ouro coloidal e intensificação pela prata. A detecção da marcação foi avaliada em microscopia de luz. Os resultados mostraram que a proteína GL tendeu a ser direcionada para localização peri-nuclear. Por outro lado, AK demonstrou um comportamento diferente. Os dados indicaram que houve uma contribuição direta das características físico-químicas das proteínas no direcionamento intracelular.