Quantitative scaling of foliage photosynthetic characteristics and release of constitutive and induced volatiles with severity of biotic stress

Plants produce a large amount of secondary metabolites including a variety of biogenic volatile organic compounds (VOCs), which can be categorized to isoprenoids, benzenoids, products of lipoxygenase (LOX) based on the biosynthesis pathway. The volatiles play a pivotal role in the interaction of plants with neighboring plants and with other organisms. Volatiles in the flower or fruits serve as attractants for pollinators and seed dispersing animals; while volatiles in leaves have been reported to play a role in attracting natural enemies of feeding herbivores for indirect defense or priming/signaling among different plants and also display antimicrobial and antifungal activities. In addition, VOCs have a considerable impact on biosphere–atmosphere interactions. Not all plants constitutively emit VOCs, but all plant species can be induced to release VOCs by abiotic and biotic stress. Biotic stress, typically including pathogen infection and insect infestation results in a series of physiological changes. The genus of leaf rusts Melampsora comprises >80 species of obligate biotrophic pathogens. Among the Melampsora species, M. larici-populina is the most widespread poplar rust. Another naturally occurring antagonist of poplar trees is the petiole aphid. The aphid species in the genus Pemphigus typically induce the formation of galls on the petiole of poplar (Populus) species as the specialized primary host, and the galls formed by poplar spiral gall aphid (P. spyrothecae) are located near the middle of the petiole. Gall wasps are also tribes of obligate parasites on plant leaves. Oak tree (Quercus) is one of the most susceptible tree species to infection by diverse specialized gall wasp species. Neuroterus and Cynips taxa are listed as the most diverse gall wasp genera globally, and these genera are widely distributed in Europe. Exogenous application of MeJA has often been used to simulate the impact of a biotic stress on elicitation of jasmonate-dependent defenses. As exogenous MeJA can be applied in precisely defined doses, it can provide an invaluable quantitative model to measure of biotic stress severity using volatile responses. The majority of studies associated with plant species response to biotic stress focus on modification of photosynthetic activity and volatile profile, but the way different physiological processes scale with the severity of infestation or damage is poorly understood. Aims of the study The overall objective of this thesis was to study the effects of biotic stresses (including infections by rust fungi, wasp galls, petiole aphid galls and application of MeJA) on leaf structure and leaf chemical and photosynthetic characteristics (net assimilation rate, stomatal conductance and the intercellular CO2 con¬centration), and constitutive isoprene and induced volatile emissions in infected leaves or treated leaves. The key hypothesis through the studies was that the leaf structural, physiological changes and volatile emission scale quantitatively with the infection severity or degree of visible damage after the biotic stresses in plants. The specific aims of the thesis were: 1. to describe changes in lamina structure and changes in macroelement contents upon infestation by rust disease and galls with poplar tree and oak tree as the model species (Papers I-III); 2. to investigate mechanisms of the quantitative scaling of photosynthetic characteristics with the severity of infection by rust disease and galls (Papers I-III); 3. to examine effects of rust and gall infestation upon constitutive isoprene and induced volatile emissions and to test whether volatile release scales quantitatively with the severity of infection (Papers I-III); 4. to estimate how MeJA dose alters the total amount of volatiles released, how it affects volatile composition and how the release of volatiles scales with the concentration of MeJA (Paper IV). Main results Infections by rust and gall resulted in major decreases in leaf dry mass per unit area (MA), and MA decreased with increasing severity of rust and gall infestation. In fact, MA of was 2.4-fold lower for leaves due to M. larici-populina infection than uninfected leaves across the entire range of damage severity. MA was 1.2-fold lower due to aphid gall infestation than non-infested leaves across the entire range of damage severity in poplar tree. The reduction was greater for infections by Neuroterus species, ca. 2.0-fold to 2.6-fold compared with Cynips spp. infection where MA was reduced by 1.8-fold for the entire Mg/Ml range (Papers I-III). Across all leaves with different infestation severity, there was a negative relationship between the net assimilation rate (An) and infestation severity. Contrary to the net assimilation rate, stomatal conductance to water vapour (gs) increased linearly with the degree of M. larici-populina damage and aphid gall infestation. As a result of the reduction of An and the increase of gs, the intercellular CO2 con¬centration increased nonlinearly with increasing severity of leaf damage. Changes in stomatal conductance due to gall wasp infection were similar to changes in An, but gs was generally reduced somewhat less than An. The intercellular CO2 concentration increased linearly with increasing Mg/Ml in all cases (Papers I-III). Infection by rust and wasp gall led to a strong reduction of isoprene emission rate, and it decreased curvilinearly with increasing infection severity in all cases, but infestation by gall-forming aphids led to a non-linear increase of isoprene emission rate with increasing severity of infestation (Papers I-III). Leaf infection by M. larici-populina, four species of wasp gall and aphid gall resulted in profound changes in the emission profiles. Infestation induced emissions of a variety of stress volatiles and signaling compounds including total LOX emissions, the elicitation of terpenes and benzenoids. Across all leaves with dif¬ferent degrees of damage, the rates of emission of induced volatiles increased with infestation severity except that monoterpene emissions decreased with the degree of infection of N. anthracinus (Papers I-III). Occurrence of two emission bursts for LOX, a fast burst elicited immediately after MeJA treatment and reaching a maximum in～0.2-1 h, and a slower burst elicited in 6-10 h after MeJA treatment and reaching a maximum in～16-20 h. In the case of mono- and sesquiterpenes, only one slower burst was observed. This slower burst started in 2-6 h after MeJA treatment and reached a maximum in～15-25 h. The maximum emission rate and total MeJA-elicited emissions increased with increasing MeJA concentration, scaling positively with the degree or leaf damage (Paper IV). These results allowed separation of immediate stress responses, elicitation of gene expression and development of induced stress responses and can be used to simulate plant stress responses. As exogenous MeJA can be applied in precisely defined doses, it provides an invaluable quantitative model to study scaling of photosynthetic and volatile responses with the severity of different biotic agents.

Taimed toodavad elutegevuse käigus suurel hulgal sekundaarseid ainevahetussaadusi, sealhulgas biogeenseid orgaanilisi lenduvühendeid (VOC). Vastavalt biosünteesi radadele jaotatakse need isoprenoidideks, bensenoidideks ja lipoksügenaasi raja (LOX) saadusteks. Lenduvühenditel on oluline roll taimede suhtlemisel nii naabertaimede kui ka teiste elusorganismidega. Õitelt ja viljadelt erituvad lenduvühendid on olulised selleks, et kohale meelitada tolmeldavaid ja seemneid edasi kandvaid loomi. Lehestikust erituvad lenduvühendid aga saadavad kutsungi lehtedest toituvate putukate looduslikele vaenlastele. See signaal hoiatab ka teisi taimi herbivooride eest. Lisaks tõrjuvad lenduvühendid ka mikroobe ja seeni. Seetõttu teame, et lenduvühendid omavad märkimisväärset mõju biosfääri-atmosfääri vastastikustes protsessides. Kõik taimed ei erita lenduvühendeid pidevalt, kuid stressitingimustes (abiootiline ja biootililine stress) on nad kõik võimelised lenduvühendeid eritama. Biootilise stressi all peetakse tavaliselt silmas taimel erinevaid füsioloogilisi muutusi põhjustavaid kahjustusi, mida tekitavad patogeenid või putukad. Üle 80 liigi obligatoorseid biotroofilisi patogeene hõlmab leherooste perekond Melamspora hõlmab. Perekonnast Melamspora on kõige laialdasemalt levinud paplirooste M. larici-populina. Veel üks papli (Populus) looduslik vaenlane on leherootsu lehetäi. Papli lehetäi liik Pemphigus spyrothecae, kes elutseb leherootsu keskel, moodustab oma elutegevuse käigus papli leherootsudele pahad. Neuroterus ja Cynips on kõige liigirikkamad pahkvaablaste perekonnad maailmas ja nad on laialdaselt levinud ka Euroopas. Pahkvaablased on puulehtede obligatoorsed parasiidid ning nende rünnakutele on kõige vastuvõtlikumad tammed (Quercus). Enamus taimede biootilise stressi uuringutest keskenduvad fotosünteesi aktiivsuse muutmisele ja lenduvühendite profiilile, kuid füsioloogiliste protsesside sõltuvust parasiitide või muu kahjustuste ulatusest on veel vähe uuritud. Biootilise stressi simuleerimiseks töödeldakse taime välispidiselt metüüljasmonaadiga ning taimes hakkavad tööle sellest ainest sõltuvad kaitsemehhanismid. Kuna väliselt on MeJA võimalik lisada väga täpsetes annustes, siis saab töötlemisele järgnevate mõõtmiste abil luua kvantitatiivse mudeli, mis kirjeldab lenduvühendite eritumise hulka vastavalt biootilise stressi määrale. Töö eesmärgid Töö eesmärgiks oli uurida biootilise stressi mõju (nakatamine roostega, pahkvaablastega, leherootsu täidega ja MeJA töötlemisega) lehe struktuurile, keemilisele koostisele ja fotosünteesile (kogu assimilatsioon, õhulõhede juhtivus, rakusisene CO2 sisaldus) ning konstitutiivset isopreeni ja lenduvühendite eritumist nakatatud/töödeldud lehtedes. Töö hüpoteesiks oli, et biootilise stressi korral toimuvad lehes struktuursed ja füsioloogilised muutused ning lenduvühendite emissioon on kvantitatiivselt sõltuv nakatumise ulatusest või lehe nähtavate kahjustuste ulatusest. Töö alaeesmärgid olid: 1. kirjeldada muutusi lehelaba struktuuris ja makroelementide sisalduses pärast roostega nakatumist ja pahkvaablaste kahjustust mudel-liikidel pappel ning tamm (I-III); 2. uurida kvantitatiivselt fotosünteesi tunnuste muutusi sõltuvalt roostega nakatumisest ja pahkade moodustumisest (I-III); 3. uurida, millist mõju avaldavad rooste ja pahkadega nakatumine isopreenide konstitutiivsele ja lenduvühendite indutseeritud emissioonile ning teha kindlaks, kas lenduvühendite hulk on vastavuses kahjustuste määraga (I-III); 4. hinnata MeJA doosi mõju vabanenud lenduvühendite hulgale ja koostisele ning teha kindlaks lenduvühendite emissiooni hulga seos MeJA kontsentratsiooniga (IV). Töö tulemused Roostega nakatumise, pahku moodustavate lehetäide ja pahkvaablaste parasiteerimise tulemusel langes märkimisväärselt lehtede kuivmass lehepinna kohta (MA). MA kahanes rooste, lehetäide ja pahkvaablaste poolt põhjustatud kahjustuste suurenedes. Võrreldes nakatamata lehtedega oli MA 2,4 korda madalam lehtedel, mis olid nakatatud liigiga M. larici-populina. Seaduspära kehtis kahjustuse kõigi erinevate ulatuste korral. Paplil oli leherootsu lehetäide kahjustustega lehtede MA 1,2 korda madalam kui tervetel lehtedel. Liigiga Neuriterus nakatumisel oli lehtede kuivmassi vähenemine suurem - umbes 2,0 – 2,6 korda, võrreldes Cynips spp. nakatumisega. Viimasel juhul kahanes kõige enam infitseeritud (suurim Mg/Ml) lehtedel MA 1,8 korda (I-III). Kokku kõikidel lehtedel, millel oli erinev nakatamise ulatus, oli kogu assimilatsiooni (An) ja kahjustuse ulatuse vahel negatiivne seos. Vastupidiselt kogu assimilatsioonile, kasvas õhulõhede juhtivus veeaurule (gs) M. larici-populina põhjustatud kahjustustes ja pahkvaablaste parasiteerimisel lineaarselt. Kahjustuste ulatuse suurenedes ning An kahanemise ja gs tõusu tulemusena kasvas rakusisene CO2 kontsentratsioon mittelineaarselt. Pahkvaablaste kahjustusega lehtede õhulõhede juhtivus muutus sarnaselt kogu assimilatsioonile, kuid gs vähenes üldiselt mõnevõrra vähem kui An. Rakusisene CO2 kontsentratsioon kasvas kõikidel juhtudel lineaarselt koos kasvava Mg/Ml-ga (I-III). Rooste ja pahkvaablaste kahjustus tingis tugeva isopreeni emissiooni vähenemise. Isopreeni hulga langust vastavalt infektsiooni ulatusele kirjeldab kõverjooneline (curvilinear) graafik. Pahku moodustavate täide kahjustuste tõttu suurenes isopreeni eritumine lineaarselt vastavalt parasiitide kahjustuse ulatusele (I-III). M. larici-populina, nelja erineva pahkvaablase ja täi poolt põhjustatud lehekahjustuste tulemuseks olid märkimisväärsed muutused lenduvühendite emissiooni profiilides. Kahjustused tingisid erinevate stressi- ning signaalühendite emissiooni, mille hulgas olid kõik lenduvad LOX komponendid, ning kutsusid esile terpeeni ja bensenoidi lendumise. Kõikidel lehtedel ning kõikide kahjustuste määrade juures kasvas vastavalt ka indutseeritud lenduvühendite emissioon, välja arvatud monopterpeenide emissioon, mis langes N. anthrancinus kahjustuse puhul (I-III). LOX emissioonil esines kaks kõrgpunkti – kiire purse vahetult pärast MeJA-ga töötlemist, mis jõudis maksimumini ~ 0,2-1 tunni jooksul ning aeglasem purse, mis ilmnes 6-10 tundi pärast MeJA-ga töötlemist maksimumiga ~16-20 tundi pärast töötlust. Mono- ja seskviterpeenide eritumise puhul oli näha ainult üks aeglaselt tekkiv kõrgpunkt. See algas 2-6 tundi pärast MeJA-ga töötlemist ja jõudis maksimumini ~15-25 tunni möödudes MeJA-ga pritsimisest. Maksimaalne emissiooni tase ja kogu MeJA poolt esile kutsutud emissioon kasvas koos suureneva MeJA kontsentratsiooniga ning oli positiivses suhtes lehtede kahjustuste ulatusega (IV). Need tulemused võimaldasid eristada geeni ekspressioonist tingitud kohest vastust stressile indutseeritud stressivastuse arenemisest. Tulemuste põhjal eristati taime kohest stressireaktsiooni, geenide ekspresseerumist ja indutseeritud stressireaktsiooni, mistõttu saab tulemusi kasutada taime stressivastuste simuleerimiseks. Doosipõhine eksogeense MeJA kasutamine loob väärtusliku kvantitatiivse mudeli, mis võimaldab uurida fotosünteesi ja lenduvühendite eritumist sõltuvalt erinevatest biootilistest teguritest ja stressi tõsidusest.