Bacteriophages and extracellular vesicles of the gut microbiota : development of new study tools and roles in Inflammatory Bowel Disease (IBD) | Bactériophages et vésicules extracellulaires du microbiote intestinal : développement de nouveaux outils d’étude et rôles dans les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI)

anglais. Although widespread in developed countries, chronic inflammatory bowel diseases (IBD), which include Crohn's disease, are only partially understood. Although their symptoms are now well known, these pathologies are difficult to diagnose in patients, due to the absence of biomarkers and our lack of knowledge regarding their etiology. However, it is commonly accepted that these pathologies are accompanied by imbalances in the intestinal microbiota, called dysbiosis. Whether they are the origin or the consequence of IBD, these dysbiosis, mostly studied by metagenomics, do not only concern the bacteria of the intestinal microbiota. Indeed, phages, natural predators of bacteria, could, as some publications hypothesize, play a role in Crohn's disease.The main objective of my thesis was to enumerate phages, as well as extracellular vesicles (EVs), also potentially impacted during IBD, in the stools of healthy individuals and patients with Crohn's disease, in order to better understand their roles in this disease.First, I optimized a protocol based on the use of epifluorescence microscopy for the enumeration of Virus Like Particles (VLPs), which, in the intestinal microbiota, correspond in majority to phages. The stools of healthy individuals and of patients with Crohn's disease in relapse or remission were analyzed. The VLPs/bacteria ratio was found to be 100 times higher in the stools of patients facing a flare than in healthy individuals, suggesting that intestinal phages are much more numerous during the crises.I also developed a protocol for enumerating extracellular vesicles, using the Videodrop (Myriade), a novel optical device based on Interferometric Light Microscopy (ILM). The development of this enumeration protocol was an opportunity to compare the performance of the Videodrop to two devices based on a similar technology, the Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Although it has a higher detection threshold than the NTA devices, which means that some of the vesicles cannot be detected, the Videodrop proved to be the most practical and fastest to use of the three devices tested. A three-fold increase in the median EVs/bacteria ratio was observed in the group of patients in the flare phase compared to healthy individuals.The results obtained during this thesis highlight the increase in the number of viral particles in the stools of patients with Crohn's disease during the flare phases. Several hypotheses, which remain to be verified, could explain these results. First, it is possible that the intestinal inflammation is an inducer of prophages initially present in the microbiota. Second, a sudden increase in viruses in the gut microbiota could lead to an inflammatory phase. If this increase in the VLPs/bacteria ratio is specific to Crohn's disease, which remains to be investigated, this could eventually lead to the development of a new marker for this pathology.

français. Bien que répandues dans les pays développés, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), qui incluent la maladie de Crohn, ne sont que partiellement comprises. Si leurs symptômes sont désormais bien connus, ces pathologies sont difficiles à diagnostiquer chez les patients, du fait de l’absence de biomarqueur et de notre méconnaissance concernant l’étiologie de celles-ci. Il est cependant communément admis que ces pathologies s’accompagnent de déséquilibres du microbiote intestinal, appelés dysbioses. Qu’elles soient à l’origine ou la conséquence des MICI, ces dysbioses, majoritairement étudiées par métagénomique, ne concernent pas uniquement les bactéries du microbiote intestinal. En effet, les phages, prédateurs naturels des bactéries, pourraient, comme quelques publications en font l’hypothèse, jouer un rôle dans la maladie de Crohn.L’objectif principal de ma thèse aura été de dénombrer les phages, ainsi que les vésicules extracellulaires (VE), également potentiellement impactées au cours des MICI, dans les selles d’individus sains et de patients atteints de la maladie de Crohn, afin de mieux comprendre leurs rôles dans cette maladie.Dans un premier temps, j’ai optimisé un protocole basé sur l’utilisation de la microscopie par épifluorescence pour le dénombrement des Virus Like Particles (VLPs), qui, dans le microbiote intestinal, correspondent en majorité à des phages. Les selles d’individus sains et de patients atteints de la maladie de Crohn en période de poussée ou de rémission ont ainsi été analysées. Le ratio VLPs/bactérie s’est ainsi révélé être 100 plus élevé chez les patients en poussée par rapport aux individus sains, suggérant que les phages intestinaux sont beaucoup plus nombreux chez les patients en poussée.J’ai également mis au point un protocole d’énumération des vésicules extracellulaires, en utilisant le Videodrop (Myriade), un nouveau dispositif optique basé sur l’Interferometric Light Microscopy (ILM). La mise au point de ce protocole de dénombrement aura été l’occasion de comparer les performances du Videodrop à deux appareils reposant sur l’utilisation d’une technologie proche, le Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Bien qu’ayant un seuil de détection plus élevé que les appareils NTA, ce qui fait qu’une partie des vésicules ne peut pas être détectée, le Videodrop s’est révélé être le plus pratique et le plus rapide d’utilisation des trois appareils testés. Une augmentation d’un facteur trois de la médiane des ratio VE/bactérie a été observé dans le groupe des patients en phase de poussée par rapport aux individus sains.Les résultats obtenus au cours de cette thèse mettent en lumière l’augmentation du nombre de particules virales dans les selles des patients atteints de la maladie de Crohn au cours des phases de poussée. Plusieurs hypothèses, qui restent à être vérifiées, pourraient expliquer ces résultats. Premièrement, il est possible que l’inflammation intestinale soit inductrice de prophages initialement présents au sein du microbiote. D’autre part, une soudaine multiplication de virus dans le microbiote intestinal pourrait conduire à une poussée inflammatoire. Si cette augmentation du ratio VLPs/bactérie est spécifique de la maladie de Crohn, ce qui reste à investiguer, cela pourrait permettre, à terme, la mise au point d’un nouveau marqueur de cette pathologie.