Meiotic arrests : from gene defects identification to therapeutic approaches | Les arrêts méiotiques : de l'identification des défauts génétiques à l'approche thérapeutique

anglais. Azoospermia, defined as the absence of sperm in the ejaculate, affects 1% of men. It is either linked to a defect in spermatogenesis, or to an obstacle on the ejaculatory tract. For these patients, only the recourse to an invasive surgical procedure, a testicular biopsy (BT), will make it possible to find spermatozoa and to offer in vitro fertilization treatment. In case of non-obstructive azoospermia (NOA) due to impaired spermatogenesis, the chances of success have been estimated at 40%. However, there are no predictive criteria for rejecting such a gesture, and new markers are therefore necessary.Recent data in the literature show that whole-genome analysis would identify genetic abnormalities, particularly in the event of testicular maturation arrest (MA), a histological phenotype where no spermatozoa are found.The objective of my work was to carry out genetic investigations on this complete MA phenotype and to demonstrate that performing a complete genome analysis would allow better clinical management of these patients. Based on an alteration of a single gene per patient, we sought to confirm the genetic heterogeneity of the complete MA, and to validate the human phenotype by reproducing, in a mouse model, a genetic alteration known in the human MA.For the first axis of this project, we have:1: Identified, for the first time, a deleterious homozygous variant in the MEI1 gene, which encodes a protein known only in murine meiosis, by analyzing two infertile brothers born to consanguineous parents.2: Performed whole-exome sequencing of a cohort of 26 unrelated MA individuals and identified deleterious bi-allelic mutations in 16 candidate genes in 15 subjects. In total, a genetic alteration alteration was identified in 58% of patients, and 100% in consanguineous patients. First, we identified pathogenic variants in meiotic genes previously described in the literature, supporting the clinical significance of these genes in human MA. Additionally, we found strong evidence for testicular genes responsible for MA. The pathogenic effect of the identified variants was validated by the absence or reduction in the expression of altered proteins in testicular biopsies from patients. This made it possible to propose a new approach in the clinical care of MA patients.3: Identified a deleterious mutation in the RBMXL2 gene, leading to an alteration in the expression of many proteins essential for spermatogenesis, including MLH1, MEI1, MEIOC, and STAG3, by deregulation of the testicular spliceosome.4- Demonstrated the possibility of the occurrence of several abnormalities by studying patients with a chromosomal rearrangement.For the second axis of this project, we generated a mouse model of the recurrent deletion of the TEX11 gene in human MA, using CRISPR/Cas9 technology, to validate its impact on spermatogenesis. Surprisingly, no difference was observed in fertility, spermatogenesis or RNA sequencing results between wild-type mice and Tex11del/Y mice. These results question the validity of the use of the mouse model and/or the impact of such a deletion on spermatogenesis in humans, and/or the genetic and molecular mechanisms of MA in mice.Finally, this work shows the interest and efficiency of the combination of whole-exome sequencing and CRISPR/Cas9 technology to explore complete MA. We have demonstrated the genetic heterogeneity of complete MA and shown the importance of genetic diagnosis of this phenotype for better patients’ management. In addition, our first generated murine model showed the need to validate the human variants identified in vivo.

français. L’azoospermie, définie comme l’absence de spermatozoïde dans l’éjaculat, concerne 1% des hommes. Elle est soit liée à un défaut de la spermatogénèse, soit à un obstacle sur les voies éjaculatrices. Pour ces patients, seul le recours à un geste chirurgical invasif, une biopsie testiculaire (BT), permettra de retrouver des spermatozoïdes et de proposer une prise en charge en fécondation in vitro. En cas d’azoospermie non-obstructive (ANO) par troubles de la spermatogenèse, les chances de succès ont été estimées à 40%. Or, il n’existe pas de critères prédictifs permettant de récuser un tel geste, et de nouveau marqueurs sont donc nécessaires.Les données récentes de la littérature montrent que l’analyse du génome entier permettrait d’identifier des anomalies génétiques et en particulier en cas d’arrêt de maturation (AM) testiculaire, un phénotype histologique d’ANO, où aucun spermatozoïde n’est retrouvé.L’objectif de mon travail a été de réaliser des investigations génétiques sur ce phénotype d’AM complet et de démontrer que la réalisation d’une analyse complète du génome permettrait une meilleure prise en charge de ces patients. Sur la base d'une altération d’un gène unique par patient, nous avons cherché à confirmer l'hétérogénéité génétique de l’AM complet, et de valider le phénotype humain en reproduisant, dans un modèle murin, une altération génétique connue dans l’AM humain.Pour le premier axe de ce projet nous avons :1 : identifier, pour la première fois, un variant homozygote délétère dans le gène MEI1, qui code pour une protéine connue seulement dans la méiose murine, par l’analyse de deux frères infertiles nés de parents consanguins.2 : réalisé le séquençage exomique complet d’une cohorte de 26 individus AM non apparentés et avons identifié chez 15 sujets des mutations bi-alléliques délétères dans 16 gènes candidats. Au total, une altération a été identifiée chez 58% des patients, et 100% chez les patients consanguins. Nous avons identifié des variants pathogènes dans des gènes méiotiques précédemment décrits dans la littérature, soutenant la signification clinique de ces gènes dans l’AM. De plus, nous avons trouvé des preuves solides de variants pathogènes sur d'autres gènes à expression testiculaire, responsables d’AM. L’effet pathogène des variants identifiés a été validé par l'absence ou la réduction de l'expression des protéines altérées dans les biopsies testiculaires des patients. Ceci a permis de proposer une nouvelle approche dans la prise en charge des patients.3 : identifier une mutation délétère du gène RBMXL2, conduisant à une altération de l’expression de nombreuses protéines essentielles à la spermatogenèse, par dérégulation du spliceosome testiculaire.4- démontrer la possibilité de l’occurrence de plusieurs anomalies par l’étude de patients porteurs d’un remaniement chromosomique.Pour le deuxième axe de ce projet, nous avons généré un modèle murin de la délétion récurrente du gène TEX11 dans l’AM humain, en utilisant la technologie CRISPR/Cas9, pour valider son impact sur la spermatogenèse. Étonnamment, aucune différence n’a été observée dans les résultats de fertilité, de spermatogenèse ou de séquençage d'ARN entre les souris sauvages et les souris Tex11del/Y. Ces résultats interrogent sur la validité de l'utilisation du modèle murin et/ou sur l'impact d'une telle délétion sur la spermatogenèse chez l’humain et/ou sur les mécanismes génétiques et moléculaires d’AM chez la souris.Finalement, ces travaux montrent l’intérêt et l’efficacité de la combinaison du séquençage exomique et de la technologie CRISPR/Cas9 pour explorer les AM complets. Nous avons démontré l’hétérogénéité génétique de l’AM complet, et montré l'importance du diagnostic génétique de ce phénotype pour une meilleure prise en charge des patients. De plus, notre premier modèle murin généré a montré la nécessité de valider les variants humains identifiés.