Role and function of ROP6 signaling platform during cell signaling | Role et fonction des plateformes de signalisation membranaires contenant la Rho GTPase ROP6 lors de la signalisation cellulaire

anglais. The cell membrane is composed of a myriad of different lipids and proteins. It is known to beboth heterogeneous (juxtaposition of domains) and dynamic (diffusion of these constituents).In addition, the plasma membrane is at the interface of the cell and control the perception andintegration of biological signals. The molecular players can be compartmentalised to respondto different signals (Jaillais and Ott, 2020). This is the case for Rho of Plant (ROP) GTPases,which have been described as a family of key players in the response to different signals: Auxin,ABA, response to pathogen response, osmotic signalling and symbiosis (Basu et al., 2008; Linet al, 2012 ; Poraty-Gavra et al., 2013 ; Choi et al., 2014 ; Lin et al., 2015 ; Engelsdorf et al.,2018; Feiguelman et al., 2018; Platre et al., 2019; Smokvarska et al., 2020). Interestingly, thispleiotropic role also exists at the level of a single ROP isoform. ROP6 has been described as aregulator of auxin and osmotic signalling (Platre et al., 2019; Smokvarska et al., 2020). In roots,we found that ROP6 forms nanodomains during these two signalling processes. During osmoticsignalling, ROP6 forms nanodomains in association with RBOHDs and F allowing theaccumulation of reactive oxygen species (ROS). However, in response to auxin, ROP6nanodomains do not associate with RBOHs (Platre et al., 2019; Smokvarska et al., 2020). Thus,a question is emerging: How can the organisation of ROP6 nanodomains induce a specificresponse downstream of the different signals? We therefore set out to determine how ROP6activators can help encode a specific response at the cellular level. Using a reverse geneticscreen, we found that guanine exchange factor 14 (GEF14) is necessary and specific forinducing osmotic signalling in plant cells. Based on genetic and GTPase activation sensorexperiments, we show that GEF14 acts as an activator of ROP6 in planta. Using super resolution microscopy, we showed that ROP6 nanodomains induced by the osmotic signal, butnot those induced by auxin, require GEF14 to form. Finally, we show that GEF14 restructuresinto clusters after an osmotic signal. We extended our model to immune signalling where wesimilarly identified a specific GEF isoform. In a second part, I sought to determine how GEF14was activated by the osmotic signal. Using a comparative biochemical approach, I identified 5phosphorylation sites in the PRONE domain of GEF14. The GEF14 interactome led us to identifycandidate kinases and phosphatasesthat need to be confirmed by reverse genetic approaches.Our results suggest that the activation of a GEF isoform can determine the early stages ofsignalling and act on the specific recruitment of effector proteins. This mechanism makes itpossible to maintain and control early cell signalling in plants

français. La membrane cellulaire est composée d'une myriade de lipides et de protéines différentes. Elleest connue pour être à la fois hétérogène (juxtaposition de domaines) et dynamique (diffusionde ces constituants). En outre, la membrane plasmique est l'interface de la cellule permettantla perception et l'intégration des signaux biologiques. Les acteurs moléculaires membranairespeuvent être compartimentés pour répondre à différents signaux (Jaillais et Ott, 2020). C'estle cas des GTPases Rho of Plant (ROP) qui ont été décrites comme une famille d'acteurs clésdans la réponse à différents signaux : Auxine, ABA, réponse aux pathogènes, signalisationosmotique, symbiose (Basu et al., 2008 ; Lin et al., 2012 ; Poraty-Gavra et al., 2013 ; Choi et al.,2014 ; Lin et al., 2015 ; Engelsdorf et al., 2018 ; Feiguelman et al., 2018 ; Platre et al., 2019 ;Smokvarska et al., 2020). De manière intéressante, ce rôle pléiotrope existe également àl'échelle d'une seule isoforme de ROP. En effet, ROP6 a été décrite comme régulateur de lasignalisation auxinique et osmotique (Platre et al., 2019 ; Smokvarska et al., 2020). Dans lesracines, nous avons constaté que ROP6 forme des nanodomaines lors ces deux signalisations.Lors de la signalisation osmotique, ROP6 forment des nanodomaines en association avecRBOHD et F permettant l'accumulation d'espèce réactive de l'oxygène ou ROS. En revanche,en réponse à l'auxine, les nanodomaines de ROP6 ne s'associent pas avec RBOH (Platre et al.,2019 ; Smokvarska et al., 2020). Une question émerge : comment l'organisation desnanodomaines de ROP6 peut-elle induire une réponse spécifique en aval de différents signaux? Nous avons donc cherché à déterminer comment les activateurs de ROP6 peuvent participerà encoder une réponse spécifique au niveau cellulaire. Par un crible génétique inverse, nousavons découvert que le facteur d'échange de guanine 14 (GEF14) est nécessaire et spécifiquepour induire la signalisation osmotique dans les cellules végétales. Sur la base d'expériencesgénétiques et de senseurs d'activation des GTPases, nous montrons que GEF14 agit comme unactivateur de ROP6 in planta. Par microscopie à super-résolution, nous avons montré que lesnanodomaines ROP6 induits par le signal osmotique, mais pas ceux induits par l'auxine, ontbesoin de GEF14 pour se former. Enfin, nous montrons que GEF14 se restructure en clustersous l'effet d'un signal osmotique. Nous avons étendu notre modèle à la signalisationimmunitaire où nous avons identifié de la même manière un isoforme GEF agissantspécifiquement. Dans une seconde partie, j'ai cherché à déterminer comment GEF14 étaitactivé par le signal osmotique. Par une approche de biochimique comparative, j'ai mis enévidence 5 sites de phosphorylations dans le domaine PRONE de GEF14. L'interactome deGEF14 nous a orienté sur des kinases candidates qui devront être confirmées par desapproches de génétique inverse.Ainsi, nos résultats suggèrent que l'activation d'une isoforme GEF peut déterminer lespremières étapes de la signalisation et agir sur le recrutement spécifique de protéineseffectrices. Ce mécanisme permettant de maintenir et contrôler la signalisation cellulaireprécoce chez les plantes.