'Candidatus Mycoplasma haematoalbiventris' e patógenos transmitidos por carrapatos em Didelphis albiventris de Curitiba e Foz do Iguaçu, Paraná, Brasil

Orientador: Prof. Dr. Rafael Felipe da Costa Vieira

Coorientadora: Dra. Thállitha Samih Wischral Jayme Vieira

Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Defesa : Curitiba, 06/08/2021

Inclui referências

Resumo: Gambás são reconhecidos como possíveis reservatórios para patógenos de importância na Saúde Única. Sendo assim, o monitoramento destes marsupiais é crucial para estabelecer o controle de doenças emergentes e re-emergentes. Assim como outras espécies, os gambás são infestados por ectoparasitas, carrapatos e pulgas, vetores de patógenos como Ehrlichia sp., Anaplasma sp., Babesia sp., Rickettsia sp., entre outros. Estes animais podem ser peça chave para a permanência de ciclos das bactérias e protozoários e, por este motivo o presente estudo visa investigar a ocorrência e a diversidade genética de patógenos transmitidos por carrapatos e micoplasmas hemotrópicos que infectam gambás e ectoparasitas associados nas cidades de Curitiba e Foz do Iguaçu, Paraná, Brasil. No total, 30 gambás-de-orelha-branca (Didelphis albiventris) foram avaliados entre junho de 2018 e dezembro de 2020, sendo 13 deles capturados em Foz do Iguaçu e 17 em Curitiba. Para a avaliação, os animais foram contidos quimicamente, identificados e inspecionados para a presença de ectoparasitos. Foi coletado sangue por punção venosa da cauda ou jugular dos animais para posterior análise molecular. O DNA foi extraído utilizando-se kit comercialmente disponível. Em todas as amostras foi realizada uma PCR para o gene endógeno de mamífero gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapdh) e, posteriormente, as amostras foram triadas para Mycoplasma sp. hemotrópicos, usando PCR convencional para um fragmento do gene 16S rRNA de hemoplasmas. Amostras de DNA de gambás de orelha branca que testaram positivas para hemoplasmas foram submetidas a uma PCR gênero-específica para um fragmento (~800 pb) do gene 23S rRNA de hemoplasmas. Além disso, as amostras de DNA também foram testadas por PCR para um fragmento (551 pb) do gene 18S rRNA de Theileria/Babesia spp. e um fragmento (349 pb) do gene 16S rRNA de Ehrlichia/Anaplasma spp. Todos os gambás de orelha branca de ambas as localidades não estavam infestados por ectoparasitas no momento da coleta e todas as amostras amplificaram consistentemente o gene gapdh. Dois dos 13 (15,38%; IC 95%: 4,33-42,23%) gambás de orelha branca do município de Foz do Iguaçu foram positivos para hemoplasmas, enquanto os animais de Curitiba testaram-se negativos. Amplicons (~900 bp) dos genes 16S rRNA e 23S rRNA obtidos das amostras positivas para hemoplasmas foram sequenciadas em ambas as direções pelo método de Sanger. As sequências de nucleotídeos dos genes 16S rRNA e 23S rRNA dos hemoplasmas amplificados neste estudo foram submetidos ao banco de dados genéticos GenBank® (números de acesso: MW703800, MW703801, e MW694786, MW694787, respectivamente). O sequenciamento do fragmento do gene 16S rRNA mostrou 100% de identidade com ‘Candidatus Mycoplasma haemoalbiventris’ e, do fragmento do gene 23S rRNA mostrou identidade variando de 99,74-100% com ‘Ca. M. haemoalbiventris’ detectado em gambás-de-orelha-branca de duas regiões do Brasil. Todos os gambás, de ambas as localidades, foram negativos para Theileria/Babesia spp. e Ehrlichia/Anaplasma spp. Pela PCR. A presença de ‘Ca. M. haemoalbiventris’ em gambás-de-orelha-branca na cidade de Foz do Iguaçu-PR, indica que estes animais podem albergar uma ampla diversidade de hemoplasmas sendo necessário o desenvolvimento de estratégias de controle e dispersão de patógenos associado ao gênero Didelphis sp.

Abstract: Opossums are recognized as possible reservoirs for diseases of importance in One Health. Therefore, monitoring these animals is crucial to establish control of emerging diseases. Like other species, opossums are infected by ectoparasites, which are vectors of agents such as Ehrlichia sp., Anaplasma sp., Babesia sp., and hemoplasmas. These animals may be a key element for the permanence of bacterial cycles, and, for this reason, the present study aims to investigate the occurrence and genetic diversity of pathogens transmitted by ticks that infect opossums and, associated ectoparasites in the cities of Curitiba and Foz do Iguaçu, Paraná, Brazil. Thirty white-eared opossums (Didephis albiventris) were evaluated in the period between June 2018 to December 2020. Thirteen of them were captured in Foz do Iguaçu and, 17 in Curitiba. After chemical restraint, animals were individually identified and visually inspected for ticks and fleas. Blood samples were collected for posterior molecular analysis. The DNA was extracted using a commercially available kit. To monitor DNA extraction, a PCR for the mammal endogenous gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh) was performed in all samples and, after, the samples were selected for homotropic Mycoplasma sp., using conventional PCR with genus-specific primers targeting a fragment of the 16S rRNA gene of Mycoplasma spp. Opossum DNA samples that tested positive in the PCR assay based on the 16S rRNA gene were subjected to a genus-specific PCR assay targeting a fragment (800 pb) of the 23S rRNA gene of hemoplasmas. ). Additionally, DNA samples were also tested by PCR assays targeting a fragment (551 bp) of the 18S rRNA gene of Theileria/Babesia spp. (Almeida et al., 2012) and a fragment (349 bp) of 16S rRNA gene of Ehrlichia/Anaplasma spp. Amplicons (900 bp) of two16S rRNA and three 23S rRNA Mycoplasma spp.-positive samples from Foz do Iguaçu City were sequenced in both directions by Sanger method. Nucleotide sequences of the 16S rRNA and 23S rRNA genes of hemotropic Mycoplasma sp. amplified herein were submitted to the GenBank® database (accession numbers: MW703800, MW703801, MW703802, and MW694786, MW694787, respectively). Opossums from both cities were not infested by ectoparasites (ticks and fleas) at the time of sampling and, all samples consistently amplified the mammal endogenous gapdh gene. All opossums tested negative for Theileria/Babesia spp. and Ehrlichia/Anaplasma spp. by PCR. Two animals from Foz do Iguaçu were positive for hemotropic Mycoplasma spp. by PCR. Sequencing of the 16S rRNA fragment showed 100% identity with ‘Ca. M. haemoalbiventris’ and, sequencing of the 23S rRNA fragment showed 99.74-100% identity with ‘Ca. M. haemoalbiventris’ detected in whiteeared opossums from Brazil. All opossums were negative for Theileria/Babesia spp. and Ehrlichia/Anaplasma spp. by PCR. The presence of ‘Candidatus Mycoplasma haemoalbiventris’ in white-eared opossums in Foz do Iguaçu city indicates these animals may carry a wide range of hemoplasms, requiring the development of strategies for the control and dispersion of pathogens associated with the genus Didelphis sp.