Exploring lignocellulose-based fermentation for sustainable co-production of lipids and other valuable chemicals by Mucoromycota fungi

Denne avhandlingen er et forskningsarbeid utført innenfor FME Bio4Fuels-prosjektet finansiert av Norges forskningsråd. Målet med prosjektet er å utvikle teknologier for konvertering av lignocellulosebasert biomasse og organiske rester til transportdrivstoff, samt verdiskapende kjemikalier, varme og energi, for å maksimere prosesseffektiviteten. Gjeldende CO₂-reduksjonspolitiske målsettinger definerer veien videre for overgangen fra fossile drivstoff til fornybare biodrivstoff. Selv om Norge har en sterk historie innen oljeproduksjon, ligger fokuset nå på overgangen til fornybare energiløsninger. For eksempel forventes kravene om innblanding av biodrivstoff i transportsektoren, inkludert luftfart, maritim transport og veitransport, å øke betydelig i årene fremover. Denne overgangen krever utvikling og optimalisering av teknologier for konvertering av fornybare ressurser. I Norge er skog en rikelig og fornybar ressurs som gir et bærekraftig biomassegrunnlag for biodrivstoffproduksjon. Gran er identifisert som hovedarten for produksjon av biodrivstoff og verdiskapende kjemikalier gjennom ulike konverteringsteknologier undersøkt i delprosjektene i Bio4Fuels-prosjektet. Denne doktorgradsavhandlingen er en del av et delprosjekt som fokuserer på biokjemisk konvertering av granbiomasse til lipider for biodieselproduksjon og andre verdifulle forbindelser gjennom fermentering av oleaginøse Mucoromycota-sopper. I Artikkel I ble en oversikt over Mucoromycota-rekke i konteksten av bioraffinerier presentert. Selv om dette rekke er mindre utforsket sammenlignet med Basidiomycota og Ascomycota, har flere arter hatt betydelig bioteknologisk og samfunnsmessig innvirkning. Eksempler inkluderer industriell produksjon av fumarsyre, omega-3- og omega-6-fettsyrer for kosttilskudd, en rekke enzymer til matindustrien (f.eks. lipaser, proteaser, pektinaser, amylaser) og karotenoider til fôr og næringsstoffer. Andre anvendelser som foreløpig har mindre industriell tilstedeværelse, men som viser økende markedsvekst, inkluderer kitosan til ulike formål, enzymatiske ekstrakter til hudpleieprodukter og bioetanol. Denne publikasjonen gir en oppdatert oversikt over de multifunksjonelle egenskapene til Mucoromycota-biomasse, samt råstoffer, optimale betingelser og strategier for fermentering. Analysen har også identifisert flere uutforskede nisjer. I tråd med avhandlingens og prosjektets målsettinger er utnyttelsen av granbiomasse sentralt. Gjennom en litteraturgjennomgang ble det tydelig at selv om flere studier bruker lignocellulosehydrolysater til produksjon av lipider og etanol med Mucoromycota-arter, er bruken av lignocellulose i fast form nærmest fraværende. Så vidt forfatteren vet, finnes det bare én studie som har brukt forbehandlet lignocellulose i fast form for samtidig sakkarifisering og fermentering (SSF) med to Mucoromycota-arter for bioetanolproduksjon. Produksjon av fettsyrer fra Mucoromycota ved hjelp av SSF og lignocellulose som råstoff forblir derfor overraskende lite utforsket, til tross for potensialet for biodieselproduksjon klassifisert som annen generasjons biodrivstoff. I Artikler II og III ble granhydrolysater og lignocellulosemasse produsert av Borregaard (Sarpsborg, Norge) brukt som råstoff for samproduksjon av lipider og aminopolysakkarider (kitin/kitosan) gjennom nedsenket fermentering (SmF) og SSF. Vibrasjonsspektroskopiske teknikker ble brukt for å overvåke biomassekonvertering og nedbrytning av mediekomponenter, noe som demonstrerte deres egnethet til formålet. Ettersom dette var et første SSF-eksperiment, ble enzymdosering brukt uten å ta hensyn til prosessens økonomi. For å videreutvikle SSF-prosessen ble fordelaktige egenskaper hos ulike Mucoromycota-stammer evaluert i Artikkel IV. Egenskaper som temperaturtoleranse, endringer i lipidsammensetning ved ulike dyrkingstemperaturer, cellebiosefermentering og induksjon av β-glukosidase og endoglukanase ble vurdert. Disse funnene gjorde det mulig å identifisere de mest egnede stammene for fremtidige SSF-studier. I Artikkel V ble stamtoleranse overfor H₂O₂ undersøkt for å vurdere kompatibilitet med en prosess som er designet for å forbedre sakkarifiseringseffektiviteten i SSF. Denne prosessen innebærer å øke aktiviteten til lytiske polysakkarid-monooxygenaser (LPMO-er) med H₂O₂. Fordi H₂O₂ er en reaktiv oksygenforbindelse, er det viktig å forstå stamtoleranse på forhånd. I tillegg antyder litteraturen at subletale konsentrasjoner av H₂O₂ i visse mikroorganismer kan utløse metabolske responser som fremmer akkumulering av metabolitter som karotenoider eller lipider. Eksperimenter ble gjennomført der stammer ble eksponert for subletale doser av H₂O₂ i medier med ulike karbon-til-nitrogen (C/N)-forhold for å kontekstualisere lipidakkumulering. FTIR-analyse avslørte flere effekter av sub dødelig H₂O₂-doser og C/N-forhold, og konkluderte med at flere stammer var egnet for SSF med H₂O₂. Videre rapporteres det for første gang i dette arbeidet om oksalsyreproduksjon av Absidia glauca, samt forskjellige strategier for karbonfordeling blant Mucoromycota-arter. Samlet sett legger denne doktorgradsavhandlingen et grunnlag for utforskning av lignocellulosebasert SSF ved bruk av Mucoromycota, med fokus på fremtidige bioraffinerianvendelser. Samproduksjon av flere verdifulle produkter fra Mucoromycota-sopper maksimerer økonomisk potensial samtidig som bærekraft opprettholdes gjennom fornybart råstoff.

This thesis comes as a research work performed within the Forskningssentre for miljøvennlig energi (FME) Bio4Fuels project funded by the Research Council of Norway. The aim of this project is to develop technologies for the conversion of lignocellulosic biomass and organic residues into transportation fuels, along with value-added chemicals, heat, and power, thereby maximizing process efficiency. Current CO2 reduction policies define the roadmap for transitioning from fossil fuels to renewable biofuels. While Norway has a strong history in oil production, there has been a progressive shift towards renewable energy solutions. For instance, mandates to blend biofuels into transportation fuels, including aviation, marine, and road sectors, are expected to increase significantly in the coming years. This shift requires the development and optimization of renewable resource conversion technologies. In Norway, forests are an abundant and renewable resource, which can serve as feedstock for biofuel production. Norway spruce has been identified as the primary species for biofuels and added-value chemicals production through different conversion technologies explored under different subprojects of the Bio4Fuel project. The present PhD work is part of a subproject that focuses on the biochemical conversion of Norway spruce biomass into lipids for biodiesel production and other valuable compounds through the fermentation of oleaginous Mucoromycota fungi. In Paper I, a review of Mucoromycota phylum in the context of biorefineries was presented. Although this phylum remains underexplored compared with Basidiomycota and Ascomycota, several species have had significant biotechnological and societal impacts. Examples include the industrial production of fumaric acid, omega-3 and omega-6 fatty acids for food supplements, a plethora of enzymes for the food industry (e.g., lipases, proteases, pectinases, amylases), and carotenoids for feed and nutraceuticals. Other applications with a less presence in the industry, but showing growing market potential, include chitosan for diverse uses, enzymatic extracts for skincare products, bioethanol, etc. This publication provides an updated overview of the multifunctional properties of Mucoromycota biomass, along with feedstocks, optimal conditions, and strategies for its fermentation. This analysis has also helped identify several unexplored niches. In line with the thesis and project objectives, the utilization of Norway spruce biomass is central. Upon reviewing the literature, it became evident that while numerous studies use lignocellulose hydrolysates for lipid and ethanol production with Mucoromycota species, the use of solid forms of lignocellulosic materials is almost absent. To my knowledge, only one study was identified that used pretreated lignocellulosic feedstock in solid form for simultaneous saccharification and fermentation (SSF) with two Mucoromycota species for bioethanol production. Thus, the production of fatty acids from Mucoromycota using SSF and lignocellulose as a feedstock remains surprisingly underexplored, despite the potential for producing biodiesel classified as a second-generation biofuel. In Papers II and III, Norway spruce hydrolysates and lignocellulose pulp produced by Borregaard (Sarpsborg, Norway) were used as feedstocks for the co-production of lipids and amino-polysaccharides (chitin/chitosan) through submerged fermentation (SmF) and SSF. Vibrational spectroscopy techniques were employed to monitor biomass conversion and depletion of media components, demonstrating their suitability for this purpose. However, as this was an initial SSF experiment, enzyme dosages were applied without accounting for economic viability. To further develop the SSF process, Paper IV explored beneficial traits for SSF in a set of Mucoromycota strains. Traits such as temperature tolerance, lipid changes under varying cultivation temperatures, cellobiose fermentation, and induction of β-glucosidase and endoglucanase were assessed. These findings enabled the identification of the most suitable strains for future SSF studies. In Paper V, strain tolerance to H₂O₂ was investigated to assess compatibility with a process designed to enhance saccharification. This process involves boosting the activity of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) with H₂O₂. Since H₂O₂ is also a reactive oxygen species, it is critical to understand strain tolerance beforehand. Additionally, the literature suggests that in certain microorganisms, sublethal concentrations of H₂O₂ can trigger metabolic responses that promote the accumulation of certain metabolites, such as carotenoids or lipids. Experiments were conducted exposing strains to sublethal doses of H₂O₂ in media with varying carbon-to-nitrogen (C/N) ratios to contextualize lipid accumulation. Fourier-transform infrared (FTIR) analysis revealed multiple effects of sublethal H₂O₂ exposure and C/N ratio variation, concluding with the suitability of several strains for SSF with H2O2. Furthermore, in this work, oxalic acid production by Absidia glauca is reported for the first time, and different carbon diversion strategies among Mucoromycota species were observed. Overall, this PhD thesis lays a foundational framework for exploring lignocellulose-based SSF using Mucoromycota, with a focus on future biorefinery applications. The co-production of multiple valuable products from Mucoromycota fungi maximizes economic potential while maintaining sustainability due to the renewable origin of the feedstock.