Characterization of microRNAs implicated in maritime pine resistance to pinewood nematode

Mestrado em Biologia dos Recursos Vegetais / Instituto Superior de Agronomia / Faculdade de Ciências. Universidade de Lisboa

Pine wilt disease (PWD), caused by the pinewood nematode (PWN) Bursaphelenchus xylophilus, is a serious threat to coniferous forests worldwide. Post-transcriptional regulation of gene expression by microRNAs (miRNAs) plays important roles during plant-pathogen interactions. Recently, a few miRNAs have been identified as differentially expressed between PWD resistant and susceptible maritime pine (Pinus pinaster Ait.) plants. The aim of this work was to further characterize the expression patterns of four of these miRNAs during early stages of PWN infection and evaluate how they relate with maritime pine responses. P. pinaster 4-year-old plants from half-sib families previously characterized regarding their predicted survival mean to PWN, were inoculated and symptom development was recorded. Stem samples were collected before (0 hours) and at 24, 48 and 72 hours post inoculation. After RNA extraction, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) data was obtained for quantification of miRNA expression in susceptible, resistant and control plant stem samples. First, reference miRNAs for normalization of expression data were identified using well-established algorithms. Then, a step toward functional characterization of the potentially defense-related P. pinaster miR166h, miR951f, miR3627m and Novel_110 was given by comparing their expression patterns along time between resistant and susceptible plants. The results show that miR11532_4 and miR396_48 are good reference miRNAs, being more appropriate than currently used reference genes. Expression analysis suggests the potential contribution of miR166h and miR951f upregulation to inefficient activation of susceptible plants’ immunity, as well as the possible involvement of Novel_110 in cell wall reinforcement of resistant genotypes. Furthermore, the potential regulation of oxidoreductase activity by miR3627m is discussed. Overall, valuable information on post-transcriptional regulation of maritime pine response to PWD was obtained, although further functional characterization of these miRNAs is needed. Ultimately, this knowledge might be helpful for breeding programs that aim at developing resistant P. pinaster plants.

A Doença da Murchidão do Pinheiro (DMP), causada pelo nemátode da madeira do pinheiro (NMP) Bursaphelenchus xylophilus, representa uma ameaça para as florestas de coníferas. A regulação pós-transcricional da expressão génica por microRNAs (miRNAs) é essencial nas interações planta-patógeno. Recentemente, foram identificados alguns miRNAs diferencialmente expressos entre plantas de pinheiro-bravo (Pinus pinaster Ait.) resistentes e suscetíveis à DMP. O objetivo deste trabalho foi, então, caracterizar os padrões de expressão de quatro desses miRNAs nas fases iniciais da infeção com NMP. Plantas de P. pinaster com 4 anos de idade pertencentes a famílias de meios-irmãos previamente caracterizadas foram inoculadas com NMPs, registando-se o aparecimento de sintomas ao longo do tempo. Recolheram-se amostras de caule antes da infeção (0 horas) e às 24, 48 e 72 horas após a inoculação. Após extração de RNA e síntese de cDNA, quantificou-se a expressão de miRNAs em amostras de plantas suscetíveis, resistentes e controlo através de PCR quantitativo (RT-qPCR). Inicialmente, foram identificados miRNAs de referência para normalização de dados de expressão através de algoritmos convencionais. Em seguida, compararam-se os padrões de expressão ao longo do tempo de miRNAs potencialmente envolvidos na defesa do pinheiro-bravo à DMP (miR166h, miR951f, miR3627m e Novel_110). Os resultados obtidos revelam que o miR11532_4 e miR396_48 são bons miRNAs de referência e mais apropriados do que genes tipicamente usados. A análise de expressão sugere que um aumento do miR166h e miR951f possa contribuir para a fraca imunidade em plantas suscetíveis, juntamente com um possível envolvimento do Novel_110 no reforço das paredes celulares em genótipos resistentes. É também discutida a potencial regulação da atividade de oxirredução pelo miR3627m. Em resumo, obtiveram-se informações relevantes sobre a regulação pós-transcricional da resposta do pinheiro-bravo à DMP. Este conhecimento pode ser útil para programas de melhoramento que visam o desenvolvimento de plantas resistentes de P. pinaster.

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