Optimización de la especificidad del silenciamiento génico en Nicotiana benthamiana mediante la modificación de la secuencia espaciadora de precursores mínimos de syn-tasiRNAs incluidos en vectores virales | Optimization of gene silencing specificity in Nicotiana benthamiana by modifying the spacer sequence of minimal syn-tasiRNA precursors included in viral vectors | Optimització de l especificitat del silenciament gènic en Nicotiana benthamiana mitjançant la modificació de la seqüència espaiadora de precursors mínims de syn-tasiRNAs inclosos en vectors virals

[ES] Los synthetic trans acting small interfering RNAs (syn-tasiRNAs) son un tipo de pequeños RNAs interferentes (siRNAs) de 21 nucleótidos (nt), diseñados computacionalmente para silenciar genes específicos de interés. Una característica importante de los syn-tasiRNAs es su alta especificidad, lo que permite inducir silenciamiento génico minimizando efectos inespecíficos u off-target. Recientemente, se ha observado que los syn-tasiRNAs pueden expresarse eficientemente a partir de precursores de mínimo tamaño incluidos en vectores virales, en una estrategia conocida como syn-tasiR-VIGS. Estos precursores mínimos están compuestos únicamente por un sitio diana de un microRNA endógeno de 22 nt, una secuencia espaciadora y la secuencia de uno o varios syn-tasiRNAs. La expresión de estos precursores mínimos mediante vectores virales no solo produce los syn-tasiRNAs esperados, sino también siRNAs inespecíficos generados como parte de la respuesta defensiva de la planta frente a virus. Estudios previos en el laboratorio mostraron que la expresión en Nicotiana benthamiana de un precursor mínimo que produce un syn-tasiRNA (syn-tasiR-NbSu) dirigido contra el gen SULPHUR (NbSu), e incluido en un vector viral, induce clorosis en las hojas como consecuencia de la actividad del syn-tasiRNA. Asimismo, se detectó la producción de siRNAs inespecíficos a partir del precursor mínimo, muchos de los cuales tenían en su secuencia nucleótidos de la región 3' de la secuencia espaciadora y/o de la región 5' del syn-tasiRNA, ambas ricas en adeninas (A) y uracilos (U). Por lo tanto, muchos de estos siRNAs contenían una A o U en posición 5 , lo que los convierte en muy estables y, en consecuencia, potencialmente activos en silenciamiento tanto del gen diana como de otros genes no deseados, disminuyendo así la especificidad global del silenciamiento. En este estudio, se buscó aumentar la especificidad del silenciamiento génico inducido por syn-tasiR-VIGS en N. benthamiana. Para ello, se modificó la secuencia espaciadora original de un precursor mínimo de syn-tasiRNAs por otra compuesta exclusivamente por guaninas (G) y citosinas (C), con el objetivo de que los siRNAs derivados de ella portaran una G o C en el extremo 5', haciéndolos menos estables y, en consecuencia, menos activos. En primer lugar, en ensayos de expresión transitoria en N. benthamiana, se confirmó que la acumulación del syn-tasiR-NbSu expresado a partir de un precursor mínimo con esta modificación, e incluido en un transgén, no se veía afectada. Posteriormente, al expresar el syn-tasiRNA mediante un vector viral, se observó una reducción en la producción de siRNAs inespecíficos derivados del syn-tasiRNA cuando se utilizó la secuencia espaciadora modificada, en comparación con los generados a partir del precursor mínimo original. Estos resultados sugieren que dicha modificación mejora la especificidad del silenciamiento inducido y respaldan la exploración de estrategias complementarias, como la modificación de las primeras bases del syn-tasiRNA para enriquecerlas en Gs y Cs, lo que podría prevenir la producción de siRNAs activos derivados de esta región y mejorar aún más la especificidad del silenciamiento.

[EN] Synthetic trans-acting small interfering RNAs (syn-tasiRNAs) are 21-nucleotide (nt) small RNAs, computationally designed to silence specific target genes. A key feature of syn-tasiRNAs is their high specificity, which allows gene silencing with minimal off-target effects. Recently, syn-tasiRNAs have been efficiently expressed from minimal-sized precursors delivered through viral vectors, in a strategy known as syn-tasiR-VIGS. These minimal precursors consist solely of a 22-nt target site for an endogenous microRNA, a spacer sequence, and one or more syn-tasiRNAs. Expression of these minimal precursors via viral vectors leads to the production of both the intended syn-tasiRNAs and non-specific siRNAs, the latter resulting from the plant s antiviral defense response. Previous studies in the lab showed that expression in Nicotiana benthamiana of a minimal precursor encoding a syn-tasiRNA targeting the SULPHUR (NbSu) gene (syn-tasiR-NbSu), delivered by a viral vector, induces leaf chlorosis due to syn-tasiRNA activity. However, non-specific siRNAs were also detected, many of which contained nucleotides from the 3' region of the spacer and/or the 5' region of the syn-tasiRNA, both rich in adenines (A) and uracils (U). Consequently, many of these siRNAs carried an A or U at the 5' end, making them highly stable and potentially active in silencing both the target gene and unintended ones, thus reducing the overall silencing specificity. This study aimed to improve the specificity of syn-tasiR-VIGS induced gene silencing in N. benthamiana. To this end, the original spacer sequence of a minimal syn-tasiRNA precursor was replaced with a GC-rich sequence, with the goal of generating siRNAs with a guanine (G) or cytosine (C) at the 5' end, making them less stable and, consequently, less active. Transient expression assays in N. benthamiana confirmed that syn-tasiR-NbSu accumulation from the modified minimal precursor, included in a transgene, was not affected. Moreover, when expressed the syn-tasiRNA using a viral vector, a reduction in the production of nonspecific siRNAs derived from syn-tasiRNA was observed when the modified spacer sequence was used, compared to those generated from the original minimal precursor. These findings suggest that this modification improves the specificity of the induced silencing and support the exploration of complementary strategies, such as modifying the first bases of syn-tasiRNA to enrich them in Gs and Cs, which could prevent the production of active siRNAs derived from this region and further improve silencing specificity.

López Esteve, S. (2025). Optimización de la especificidad del silenciamiento génico en Nicotiana benthamiana mediante la modificación de la secuencia espaciadora de precursores mínimos de syn-tasiRNAs incluidos en vectores virales. Universitat Politècnica de València. https://riunet.upv.es/handle/10251/221318

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