Estudio del impacto de la infección por el Mal de Rio Cuarto virus (MRCV) en el metabolismo de gramíneas y análisis del rol de las proteínas virales con posible localización nuclear en la patogénesis

Tesis presentada para optar al título de Doctor en el área Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en marzo de 2021

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la enfermedad viral más importante del maíz en nuestro país. Los síntomas pueden ser muy severos e incluyen enanismo y reducción de la producción de granos. En las plantas la replicación viral está limitada al floema, mientras que en insectos ocurre en todos los tejidos y es asintomática. Si bien se ha avanzado en el estudio de esta enfermedad, aún se desconocen en profundidad las bases moleculares y fisiológicas que subyacen a los síntomas y se carece de especies modelo convenientes para el estudio de esta enfermedad. Un ensayo de RNAseq realizado por nuestro grupo en hojas de trigo a 12 y 21 días posinfección (dpi) reveló que la infección por MRCV genera un profundo impacto en el transcriptoma a 21 dpi, coincidente con la aparición de los síntomas. Por su parte, a 12 dpi las plantas no presentan síntomas y solamente se identificaron unos pocos genes diferencialmente expresados. Con el objetivo de profundizar en el estudio del impacto de la infección del MRCV en gramíneas, se cuantificaron numerosos compuestos derivados del metabolismo primario y se analizó el perfil hormonal en hojas de plantas de trigo infectadas provenientes del ensayo de RNAseq mencionado. Se determinó que las hojas de plantas infectadas presentan un mayor contenido de azúcares solubles, almidón, aminoácidos, proteínas y distintos metabolitos a 21 dpi mientras que no se detectaron cambios significativos a 12 dpi. De manera interesante, uno de los metabolitos aumentados ante la infección es la Tre6P, una molécula de señalización y reguladora negativa de los niveles de sacarosa. A su vez, la Tre6P coordina el metabolismo de ácidos orgánicos y aminoácidos con la disponibilidad de carbono. En concordancia, se observó un aumento en la acumulación de ácidos orgánicos intermediarios del ciclo de Krebs. También se observaron aumentos en metabolitos importantes que intervienen en la vía del ácido shikímico que da lugar a aminoácidos y otros compuestos aromáticos, y a numerosos metabolitos secundarios. En paralelo, se determinó que a 21 dpi las hojas de plantas infectadas presentan un aumento en los niveles de Aux, JA, ABA, CKs y BRs en sus formas activas e inactivas. Por último, se midió el impacto de la infección en la acumulación de lípidos en hojas de maíz colectadas a campo. Se observó un aumento de ciertos ácidos grasos, en particular de cadena muy larga (VLCFA), aunque el contenido total de lípidos no presentó alteraciones ante la infección. De manera relevante, los VCLFA están involucrados en la síntesis de hormonas como el JA y compuestos de señalización que participan en la defensa. Nuestros resultados, en conjunto con los datos transcriptómicos, demuestran que la infección por MRCV causa profundas alteraciones en el metabolismo primario y el perfil hormonal de la planta que están, en parte, asociadas con los síntomas de la enfermedad. El genoma del MRCV está formado por diez segmentos de ARN doble cadena que codifican para al menos trece proteínas. Tres de los segmentos son bicistrónicos (S5, S7 y S9). En particular, el S5 posee dos ORFs parcialmente superpuestos y codifica teóricamente para las proteínas P5-1, P5-2 y una tercera proteína de fusión (P5F) producto de un frameshift traduccional +1. Como resultado, la proteína P5F es idéntica a P5-1 en su extremo N-terminal y a P5-2 en su extremo C-terminal. A pesar de que el MRCV replica exclusivamente en el citoplasma, las proteínas virales no estructurales P5-2, P7-1, P7-2 y P8 se localizan en el núcleo de células de insecto. Con el objetivo de determinar la localización subcelular de dichas proteínas en gramíneas y de ahondar en la caracterización de las proteínas codificadas por el S5, se las expresó en protoplastos de arroz fusionadas a GFP y se observó su localización mediante microscopía confocal. Se determinó que P5-1, P5-2, P5F, P7-1, P7-2 y P8 del MRCV se localizan en el núcleo de células vegetales sugiriendo que podrían cumplir un rol en la reprogramación transcripcional del hospedante durante la infección. De acuerdo con esto, se detectó una señal de localización nuclear (NLS) en las proteínas P5-1 y P5F que podría explicar su localización. Además, mediante el uso de mutantes de deleción, se determinó que el extremo C-terminal de P5-2 y P5F y los últimos tres residuos de P5-1 contribuyen a la localización nuclear de estas proteínas. Finalmente, en concordancia con lo reportado para la proteína homóloga del fijivirus RBSDV, P5-2 se localiza exclusivamente en precursores de los cloroplastos denominados etioplastos cuando su extremo C-terminal está bloqueado por la presencia de GFP. Esto es interesante dado que los cloroplastos participan en la defensa antiviral de la planta y, en consecuencia, son un blanco común de muchos virus vegetales. En conclusión, los estudios de localización subcelular de las proteínas mencionadas permitieron avanzar en su caracterización e identificar por primera vez en fijivirus la localización subcelular de la proteína P5F. Setaria viridis es una gramínea de tipo C4, estrechamente relacionada con el maíz que se infecta con MRCV y da lugar a los mismos síntomas. Con el objetivo de desarrollar una plataforma de expresión estable en gramíneas modelo para caracterizar la participación individual de cada proteína viral en la patogénesis y los síntomas, se desarrolló una serie de vectores binarios Gateway que permiten la expresión de las proteínas en estudio fusionadas al epitope 4xcMyc específicamente en el floema o de manera ubicua y se evaluó su funcionalidad mediante ensayos de expresión transitoria en N. benthamiana seguidos por Western blot. A continuación, en el marco de una capacitación en la transformación de S. viridis en el laboratorio del Dr. Danilo Centeno (Universidade Federal do ABC, Brasil), se obtuvieron dos líneas transgénicas que expresan la proteína P7-1 en el floema o de manera ubicua respectivamente. Estas líneas fueron caracterizadas molecularmente, corroborándose la expresión de P7-1, y se obtuvieron líneas homocigotas. Si bien el fenotipo aparente de las plantas transgénicas fue normal, no fue posible ahondar en su caracterización fisiológica dado el escaso número de líneas obtenidas. Actualmente se está trabajando en la obtención de un mayor número de líneas para, evaluar el impacto metabólico y fisiológico de la expresión de P7-1 y otras proteínas virales de localización nuclear en gramíneas. Los resultados de esta Tesis constituyen un avance en la caracterización fisiológica y molecular del impacto del Mal de Río Cuarto en gramíneas y en la identificación de proteínas virales de localización nuclear y/o cloroplástica que podrían intervenir en la reprogramación génica y en consecuencia afectar la producción de síntomas propios de la enfermedad en gramíneas.

Mal de Río Cuarto virus (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causes the most important maize viral disease in Argentina. The symptoms can be very severe and include dwarfism and reduced grain production. In plants, viral replication is limited to the phloem, while in insects it occurs in all tissues and is asymptomatic. Although progress has been made in the study of this disease, the molecular and physiological bases underlying the disease symptoms in plants are unknown and a suitable model species for the study of this disease is still lacking. An RNAseq assay performed by our group in wheat leaves at 12 and 21 days’ post-infection (dpi) revealed that MRCV infection causes a profound impact on the transcriptome at 21 dpi, which coincides with the appearance of symptoms. Instead, at 12 dpi plants do not show symptoms and only a few differentially expressed genes were identified. In order to further analyze the impact of MRCV infection in grasses, numerous compounds derived from primary metabolism were quantified and the hormonal profile of infected wheat plants leafs from the aforementioned RNAseq assay was analyzed. It was established that the infected plant leafs present a higher content of soluble sugars, starch, amino acids, proteins and different metabolites at 21 dpi, while no significant changes were detected at 12 dpi. Interestingly, one of the metabolites increased by the infection is Tre6P, a signaling molecule and negative regulator of sucrose levels. In turn, Tre6P coordinates organic and amino acids metabolism with carbon availability. According to this, an increased accumulation of organic acids intermediates of the Krebs cycle was observed. We also found increases in important metabolites involved in the shikimic acid pathway that gives rise to amino acids and other aromatic compounds, and to numerous secondary metabolites. In parallel, it was also determined that infected plant leafs present an increase in the levels of Aux, JA, ABA, CKs and BRs in their active and inactive forms at 21 dpi. Finally, the impact of infection on lipid accumulation in corn leaves collected in the field was measured. It was observed an increase in certain fatty acids, particularly those of very long chain (VLCFA), although the total lipid content does not show alterations. Relevantly, VCLFAs are involved in the synthesis of hormones such as JA and signaling compounds that participate in defense. Our results, in conjunction with transcriptomic data, demonstrate that MRCV infection causes profound alterations in the plant's primary metabolism and hormonal profile that are, at least in part, associated with the disease symptoms. The MRCV genome is composed of ten double-stranded RNA segments that code for at least thirteen proteins. Three of the segments are bicistronic (S5, S7 and S9). In particular, S5 has two partially overlapping ORFs and theoretically code for the P5-1, P5-2 proteins and a third fusion protein (P5F) product of a +1 translational frameshift. As a result, the P5F protein is identical to P5-1 at its N-terminus and to P5-2 at its C-terminus. Although MRCV replicates exclusively in the cytoplasm, the non structural viral proteins P5-2, P7-1, P7-2, and P8 are located in the nucleus of insect cells. In order to determine its subcellular localization in grasses and to delve into the characterization of the proteins encoded by S5, these proteins were expressed fused to GFP in rice protoplasts and observed by confocal microscopy. It was determined that P5-1, P5-2, P5F, P7-1, P7-2 and P8 of MRCV are located in the nucleus of plant cells, suggesting that they could play a role in host transcriptional reprogramming during infection. In agreement with this, a nuclear localization signal (NLS) was detected in the P5-1 and P5F proteins which could explain their localization. Furthermore, by using deletion mutants it was determined that the C-terminus of P5-2 and P5F and the last three residues of P5-1 contribute to the nuclear localization of these proteins. Finally, in agreement with what was reported for the homologous protein of the RBSDV fijivirus, P5-2 is exclusively located in precursors of chloroplasts called etioplasts when its C-terminal end is blocked by the presence of GFP. This is interesting since chloroplasts participate in the plant antiviral defense and, consequently, are a common target of many plant viruses. In conclusion, the subcellular localization studies of the aforementioned proteins made it possible to advance in their characterization and to identify, for the first time in fijivirus, the P5F subcellular localization. Setaria viridis is a C4-type grass closely related to maize that is infected with MRCV and gives rise to the same symptoms. In order to develop a stable expression platform in model grasses to characterize the individual participation of each viral protein in the pathogenesis and the disease symptoms, a series of Gateway binary vectors that allow the expression of the proteins under study fused to the 4xcMyc epitope in all tissues or specifically in the phloem was developed. The functionality of such vectors was evaluated by transient expression assays in N. benthamiana followed by Western blot. Next, during a training in the S. viridis transformation protocol in the laboratory of Dr. Danilo Centeno (Federal University of ABC, Brazil), two transgenic lines expressing the P7-1 protein in the phloem or in a ubiquitous manner respectively were obtained. These lines were characterized molecularly, corroborating the expression of P7-1, and homozygous lines were obtained. Although the apparent phenotype of the transgenic plants was normal, it was not possible to delve into their physiological characterization given the small number of lines obtained. Currently, efforts are focused on obtaining a greater number of transgenic lines to eventually evaluate the metabolic and physiological impact of the expression of P7-1 and other viral nuclear-localized proteins in grasses. The results of this Thesis constitute an advance in the physiological and molecular characterization of the impact of Mal de Río Cuarto disease in grasses and in the identification of viral proteins with nuclear and/or chloroplastic localization that could intervene in gene reprogramming and consequently affect the production of disease symptoms in grasses.

Instituto de Biotecnología

Fil: Arellano, Sofía Maité. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: Arellano, Sofía Maité. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: Arellano, Sofía Maité. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina