ДНК-диагностика анаплазмоза крупного рогатого скота | DNA diagnostics of anaplasmosis in cattle

Английский. There was developed a DNA diagnostic method to reveal the anaplasmosis agent Anaplasma marginale in the peripheral blood of cattle. Blood samples were obtained from the tail vein with the use of ethylenediaminetetraacetic acid as an anticoagulant. The extraction of DNA was performed with the kit Sorb-M. To analyze the gene msp4 the following sequences belonging to different isolates A. marginale were used. To select primers the conserved elements of sequences were detected with the server СlustalW2. The specificity of primers was checked by a BLASTN search. The results of polymerase chain reaction (PCR) were estimated using 2% agarose gel electrophoresis. Electrophoresis was performed within 40 minutes at the field intensity 5 V/cm. Fragments of gene msp4 obtained as a result of polymerase chain reaction (PCR) were purified, ligated and cloned in E. coli cells. Transformation was performed using the heat shock method. Search for E. coli DH5-alpha colonies containing pGEM-msp4 plasmid was conducted by the PCR method using standard M13 primers with the following analysis of PCR results by electrophoresis. Target colonies of E. coli were cultured overnight at 37 deg. С in 2 ml LB medium containing ampicillin in a 100 mcg/ml concentration. Sequencing the received plasmids pGEM-msp4 was carried out by the Sanger method and the genetic analyzer Applied Biosystems 3130. This resulted in selecting primers MSP4-F and MSP4-R having the species-specificity that was further proved. The method was tested on DNA samples isolated from cow whole blood using the positive and negative controls. Due to PCR sensitivity along with the use of the selected primers, it is possible to identify 100 and more gene copies. The conducted experiments confirm the 100% repeatability and reproducibility of the present method.

Русский. Разрабатывали способ выявления ДНК возбудителя анаплазмоза Anaplasma marginale в периферической крови крупного рогатого скота. Пробы крови отбирали из хвостовой вены с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта. ДНК выделяли с помощью набора Sorb-M. Для анализа гена msp4 были использованы соответствующие последовательности, принадлежащие разным изолятам A. marginale. Выявление консервативных участков последовательностей для подбора праймеров проводили с помощью сервера СlustalW2. Видоспецифичность праймеров проверяли с использованием алгоритма BLASTN. Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) оценивали методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Электрофорез проводили в течение 40 минут при напряженности поля 5 В/см. Полученные в результате ПЦР фрагменты гена msp4 были очищены, лигированы и клонированы в клетках E. coli. Трансформацию проводили методом теплового шока. Поиск колоний E. coli DH5-альфа, содержащих плазмиду pGEM-msp4, проводили методом ПЦР с использованием стандартных праймеров M13 с последующим анализом результатов ПЦР методом электрофореза. Целевые колонии наращивали в течение ночи при 37 град. С в 2 мл среды LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Секвенирование полученных плазмид pGEM-msp4 осуществляли по методу Сэнгера и генетического анализатора Applied Biosystems 3130. В результате были подобраны праймеры MSP4-F и MSP4-R, вижоспецифичность которых была далее доказана. Способ был апробирован на образцах ДНК, выделенной их цельной крови коров, с использованием положительного и отрицательного контролей. Чувствительность ПЦР с использованием подобранных праймеров позволяет выявить 100 и больше копий гена. Проведенные испытания свидетельствуют о 100%-ной повторяемости и воспроизводимости данного метода.