Caractérisation de l'expression des gènes de biosynthèse de l'éthylène par hybridation in situ chez l'hévéa. Développement de techniques de localisation cellulaire de gènes faiblement exprimés

Dans le cadre de l'étude de la régulation par l'éthylène des mécanismes moléculaires impliqués dans la production du caoutchouc naturel, l'optimisation d'une méthode d'hybridation in situ a été envisagée chez Hevea brasiliensis. La modification de plusieurs facteurs du procotole d'HIS a apporté une diminution significative du bruit de fond. Des sondes spécifiques des 3 gènes ACO isolés ont été utilisées pour étudier l'expression différentielle de ces gènes dans différents tissus de plantules somatiques et d'écorce de rejets après une stimulation éthylénique de 8h. La caractérisation cellulaire fine de ces gènes, qui sont peu exprimés, s'est avérée délicate du fait de l'utilisation d'un système de révélation à la phosphatase alcaline qui diffuse dans les tissus après un temps trop important de révélation. De nouvelles méthodes ont été développées pour augmenter la sensibilité de détection des gènes ACO. Une amplification du marquage a été obtenue par utilisation d'anticorps couplés à des fluorochromes de type Alexa488. Cette nouvelle méthode a permis de mettre en évidence une expression des gènes HbACO-H5 et HbACO-O4.8 dans tous les tissus d'écorce de rejets et de tiges, en particulier dans les cellules laticifères. Par contre, aucune expression n'a été détectée pour HbACO-H4. Ce système a permis d'amplifier le marquage et de localiser très finement l'expression des gènes ACO. Cependant, l'utilisation de sondes plus courtes, spécifiques dans la région 3'UTR de chaque membre des ACO, n'a pas permis de faire une localisation différentielle de ces 3 gènes sur une même coupe. Une approche par RT-PCR in situ a ensuite été envisagée pour amplifier les transcrits des gènes faiblement exprimés. L'utilisation de sondes ARN après une RT-PCR in situ est préconisé pour essayer d'amplifier efficacement le marquage. Il est envisagé par la suite d'appliquer le protocole d'HIS optimisé à d'autres gènes faiblement exprimés, en particulier les ACS qui sont impliqués dans la biosynthèse de l'éthylène. De même, l'utilisation de nouveaux fluorochromes est prévue pour essayer de discriminer l'expression des gènes étudiés. (Résumé d'auteur)