Чувствительность и специфичность multiplex ПЦР Pasteurella multocida A, B, D для выявления серовариантов пастерелл | Sensitivity and specificity of multiplex PCR Pasteurella multocida A, B, D for detecting Pasterella seroviariant

Английский. The article presents data on the determination of the specificity and sensitivity of multiplex polymerase chain reaction (PCR) of a test system for diagnosing Pasteurella multocida of serovariants A, B, D. At the first stage, the specificity of common primers was studied due to which the synthesis of a fragment typical for Pasteurella multocida was conducted. It was found that by the presence of the accumulated reaction product during PCR with common primers, one can evaluate the presence of Pasteurella multocida in DNA samples isolated from various materials. The developed PCR system was tested for the possibility of the formation of non-specific amplification products using human genomic DNA, bovine, E. coli. It was revealed that with the use of human and bovine genomic DNA, the formation of non-specific amplification products ceases when the annealing temperature rises to 57 °C. While using E. coli genomic DNA, the number of non-specific PCR products decreases with increasing annealing temperature, but does not disappear completely. It was established that the presence in the reaction mixture of minimal amounts of the target DNA of pasteurellosis prevents the formation of non-specific amplicons of E. coli genomic DNA. To determine the threshold values of the concentrations of Pasteurella genomic DNA, at which the developed PCR system is able to detect Pasteurella multocida of serovariants A, B, D, an experiment was conducted using different concentrations of Pasteurella DNA in samples: the sensitivity of PCR system was 1 ng for serovariants B and D and 5 ng for serovariant A. According to the results of electrophoresis of products using the PCR system, strain KMIEV-67 was identified as Pasteurella multocida serovariant A, strain KMIEV-68 – Pasteurella multocida serovariant B, strain KMIEV-69 – Pasteurella multocida serovariant D

Русский. В статье представлены данные по определению специфичности и чувствительности мультиплекс полимеразной цепной реакции (ПЦР) тест-системы для диагностики Pasteurella multocida серовариантов A, B, D. На первом этапе была изучена специфичность общих праймеров, позволяющих проводить синтез фрагмента, характерного для Pasteurella multocida. Обнаружено, что по наличию наработанного продукта реакции при ПЦР с общими праймерами можно судить о присутствии Pasteurella multocida в пробах ДНК, выделенных из различного материала. Разрабатываемая ПЦР система была протестирована на возможность образования неспецифичных продуктов амплификации при использовании геномных ДНК человека, быка, E. coli. Выявлено, что при использовании геномных ДНК человека и быка образование неспецифичных продуктов амплификации прекращается при повышении температуры отжига до 57 ºС. При использовании геномной ДНК E. coli количество неспецифичных продуктов ПЦР снижается при повышении температуры отжига, но не исчезает полностью. Установлено, что наличие в реакционной смеси минимальных количеств целевой ДНК пастерелл препятствует образованию неспецифичных ампликонов геномной ДНК E. coli. Для определения пороговых значений концентраций геномной ДНК пастерелл, при которых разрабатываемая ПЦР система способна детектировать Pasteurella multocida серовариантов A, B, D, был проведен эксперимент с использованием различных концентраций ДНК пастерелл в пробах: чувствительность ПЦР системы составила 1 нг для серовариантов B и D и 5 нг для сероварианта А. Согласно результатам электрофоретического разделения продуктов при использовании ПЦР системы, штамм КМИЭВ-67 идентифицирован как Pasteurella multocida серовариант А, штамм КМИЭВ-68 – Pasteurella multocida серовариант B, штамм КМИЭВ-69 – Pasteurella multocida серовариант D.