Phyllody of faba bean in the Sudan. II. - Detection of the disease by light microscopy: fluorescence, bright field, interference contrast and observation of MLOs by transmission electron microscopy

Several techniques of fluorescence, light and electron microscopy were used to detect MLOs in sieve tube elements of phyllody diseased faba bean plants. The DNA-binding fluorochrome Bisbenzimid H 33258 provided satisfactory results when used with sections prepared from fresh materials using freezing microtome or cryostat and with fixed materials embedded in paraffin or historesin. While sections from fresh materials provided rapid means of indexing, historesin and paraffin have the advantage of better preservation of anatomical characteristics of plant tissues. This was particularly the case of historesin since sections were processed without removing the embedding medium. Semi-thin sections (250-350 nm) prepared from epoxy resin-embedded plant tissue are not amenable to staining with DNA-specific fluorochromes, hence they could not be used for fluorescence microscopy. Alternatively, 2 methods of ordinary light microscopy could be utilized with such sections. The first was to examine unstained sections in a light microscope with differential interference contrast of Nomarski, and the second implied staining with thionin and acridine orange and observation in a bright field microscope. Both techniques, though non-specific to MLO provided additional tool in cytopathological studies of diseased plants and could be useful in determining areas meriting further examination in electron microscopy. The presence of MLOs in plant tissues, used for light and fluorescence microscopy, was confirmed in ultrathin and semi-thin sections observed by transmission electron microscopy.

Plusieurs techniques de microscopie photonique en fluorescence et en lumière normale ainsi que de microscopie électronique ont été utilisées pour détecter les MLO à l’intérieur des tubes criblés de la féverole atteinte de phyllodie. Un fluorochrome spécifique de l’ADN, Bisbenzimid H 33258 ou réactif de Hoechst, a donné des résultats satisfaisants quel que soit le mode de préparation du matériel végétal : tissu frais coupé au cryostat, tissu fixé et inclus dans la paraffine ou dans l’historésine. Les coupes préparées à partir de matériel frais ont permis l’indexage rapide de l’infection alors que l’inclusion dans la paraffine et surtout dans l’historésine a l’avantage de faciliter la caractérisation des structures anatomiques des tissus. L’historésine présente un intérêt particulier car les coupes peuvent être colorées en présence du milieu d’inclusion. De plus, des coupes semi-fines de 250 à 350 nm d’épaisseur ont été préparées à partir de tissus fixés et inclus dans une résine époxy. Elles ne présentent pas de fluorescence. Aussi, 2 méthodes de microscopie photonique en lumière normale ont été alternativement employées : la première consiste en l’observation des coupes non colorées en contraste interférentiel de Nomarski et, la deuxième utilise la coloration par la thionine et l’acridine orange. Ces 2 techniques, bien que non spécifiques, facilitent la localisation des zones qui nécessitent une étude ultérieure en microscopie électronique. La présence des MLO à l’intérieur des tubes criblés des tissus malades a été confirmée sur les coupes ultrafines observées en microscopie électronique par transmission.