Methods of calculating total hemocyte count in Australian red-claw crayfish | Методика подсчета общего числа гемоцитов австралийского красноклешневого рака

Английский. The optimal formula for calculating the total hemocyte number (THN) of the Australian red-claw crayfish (Cherax quadricarinatus) has been established, which allows optimizing the time of counting THN without reducing accuracy. Methodical recommendations on preparing a hemolymph sample, THN calculation and differentiated calculation of hemocytes are given. It has been found out that the differences in HTN are minimal when using different formulas, which is confirmed by the analysis of variance F = 0.011, p = 0.998, the average values of THN range from 2 384 to 2 427 pcs/mcL. Conducting multiple comparisons also demonstrated that the differences between the formulas are minimal: the significance levels between the formulas were p = 0.99. The optimal formula for the Australian red-claw crayfish is: THN in 1 micL = N*10, where N is a total number of hemocytes in 25 large squares of the Gorjaev's chamber. The counting chamber should be clean, since when even small dust particles are found on the grid, hemocyte clusters can be formed which impede counting, or the result of this calculation will be incorrect, because the distribution of hemocytes on the grid will not be uniform. After filling the chamber with hemolymph, it is recommended to wait 1-1.5 min so that the movement of the hemolymph stops and the hemocytes stop moving. It is recommended to use an anticoagulant, which prevents the rapid decay of cells and promotes their uniform distribution on the grid of the chamber without developing clots (clusters) that affect the accuracy of counting. Working with the whole hemolymph implies the speed and accuracy of the researcher's actions, since it quickly coagulates and forms clusters of hemocytes. In order to avoid confusion when counting cells located on the border between squares, the Egorov's rule is used. A 400-fold magnification is optimal for counting.

Русский. Установлена оптимальная формула для подсчета общего числа гемоцитов (ОЧГ) австралийского красноклешневого рака (Сherax quadricarinatus), которая позволяет оптимизировать время подсчета ОЧГ без снижения точности. Приведены методические рекомендации по пробоподготовке образца гемолимфы, подсчету ОЧГ и дифференцированному подсчету гемоцитов. Выяснено, что отличия в ОЧГ при использовании различных формул минимальны, что подтверждается дисперсионным анализом F = 0,011, p = 0,998, средние величины ОЧГ колеблются от 2 384 до 2 427 шт./мкл. Проведение множественных сравнений также продемонстрировало, что различия между формулами минимальны: уровни значимости между формулами составляли p = 0,99. Оптимальной для использования у австралийского красноклешневого рака является формула: ОЧГ в 1 мкл = N*10, где N – общее число гемоцитов в 25 больших квадратах камеры Горяева. Счетная камера должна быть чистая, т. к. при нахождении на сетке даже мелких пылинок могут образовываться скопления из гемоцитов, которые осложняют подсчет, или результат при таком подсчете будет некорректным, поскольку распределение на сетке гемоцитов будет неравномерным. После заполнения камеры гемолимфой рекомендуется подождать 1–1,5 мин, чтобы перемещение в ней гемолимфы остановилось и гемоциты прекратили свое движение. Рекомендуется использовать антикоагулянт, он препятствует быстрому распаду клеток и способствует их равномерному распределению на сетке камеры, без образования сгустков (скоплений), которые влияют на точность подсчета. Работа с цельной гемолимфой подразумевает быстроту и точность действий исследователя, поскольку она быстро коагулирует и образует скопления гемоцитов. Во избежание путаницы при подсчете клеток, находящихся на границе между квадратами, применяют правило Егорова. 400-кратное увеличение является оптимальным для ведения подсчета.