Antibacterial resistance : Characterization of efflux pumps in the entomopathogenic bacterium Photorhabdus laumondii | Résistance aux antibactériens : Caractérisation des pompes à efflux de la bactérie entomopathogène Photorhabdus laumondii

Английский. Photorhabdus laumondii TT01 is an entomopathogenic bacterium associated with nematodes of the Heterorhabditidae family. During the stationary phase, Photorhabdus expresses an extensive secondary specialized metabolism including antimicrobials metabolites such as stilbenes and anthraquinone-yellow pigments. How Photorhabdus ensure its self-resistance against its own metabolites remains an open question. Among the best known strategies that confer MultiDrug-Resistance (MDR) in bacteria is the active efflux by pumps. The prototypical efflux system of the Resistance-Nodulation-Division (RND) superfamily is the AcrAB-TolC pump from Escherichia coli. The main objective of this work was to characterize the efflux pumps, in particular those of the RND type, and to show their implication in the export and the "self-resistance" to antimicrobials metabolites naturally produced by P. laumondii TT01.First, we characterized the RND-type efflux pumps in P. laumondii TT01. Mutations in the mdtA, acrA and acrA-like genes encoding the MdtABC, AcrAB and AcrAB-like pumps, respectively, allowed us to demonstrate that AcrAB is the major pump involved in MDR in P. laumondii TT01. Indeed, only the ΔacrA and ΔmdtAΔacrA mutants were more sensitive than the wild-type (WT) strain to antibiotics, bile salts, dyes and detergents. On the other hand, transcriptional analyses showed that only the AcrAB pump is active in vitro, in vivo, and post-mortem in the insect cadaver. Its local transcriptional repressor acrR was very poorly expressed under normal culture conditions. Furthermore, ΔacrA and ΔmdtAΔacrA were less virulent than the WT after injection into Spodoptera littoralis larvae while being as resistant as the WT to antimicrobial peptides naturally produced by the insect.Next, we were interested in studying the involvement of the AcrAB pump in the "self-resistance" in P. laumondii TT01. Interestingly, we observed that the WT exerts antimicrobial activity against its acrA mutant while the latter did not show any antimicrobial activity against itself. In addition, in vitro competition assays revealed that ΔacrA is less competitive than the WT. We also demonstrated by minimum inhibitory concentration assays that ΔacrA was more sensitive than the WT to stilbenes. In parallel, HPLC-MS analyses showed that ΔacrA has much lower amounts of stilbenes in its supernatant than the WT. On the other hand, we demonstrated that the presence of anthraquinone pigments in the supernatant of ∆acrA was reduced compared to the WT, which explains the low pigmentation of its colonies compared to those of the WT typically stained yellow.Finally, we investigated the involvement of the AcrAB pump in the survival of P. laumondii TT01. Results of monitoring the survival of WT and ∆acrA labeled strains in the insect cadaver showed that AcrAB is not involved in the survival of P. laumondii TT01 under culture conditions without the presence of other microorganisms.Together, these results reveal the pleïotropic effect of the AcrAB efflux pump in P. laumondii TT01.

Французский. Photorhabdus laumondii TT01 est une bactérie entomopathogène associée aux nématode de la famille des Heterorhabditidae. Durant la phase stationnaire, Photorhabdus exprime une panoplie de métabolites secondaires spécialisés dont des antimicrobiens comme les stilbènes et les pigments jaunes d’anthraquinone. Comment Photorhabdus s’auto-protège contre ses propores métabolites demeure une question ouverte. Parmi les stratégies les plus connues qui confèrent une « MultiDrug-Resistance » (MDR) chez les bactéries figure l'efflux actif par des pompes. Le système d'efflux prototype de la superfamille « Resistance-Nodulation-Division » (RND) est la pompe AcrAB-TolC d'Escherichia coli. L’objectif principal de ce travail était de caractériser les pompes à efflux notamment de type RND, et de montrer leur implication dans l’export et la « self-résistance » aux antimicrobiens naturellement produits par P. laumondii TT01.Dans un premier temps, nous avons caractérisé les pompes à efflux de type RND chez P. laumondii TT01. Les mutations des gènes mdtA, acrA et acrA-like codant les pompes MdtABC, AcrAB et AcrAB-like, respectivement, nous ont permis de démontrer qu’AcrAB est la pompe majeure impliquée dans la MDR chez P. laumondii TT01. En effet, seuls les mutants ΔacrA et ΔmdtAΔacrA étaient plus sensibles que la souche sauvage « WT » aux antibiotiques, aux sels biliaires, aux colorants et aux détergents. D’autre part, les analyses transcriptionnelles ont montré que seule la pompe AcrAB est active in vitro, in vivo et post-mortem dans le cadavre de l’insecte. Son répresseur transcriptionnel local acrR était très mal exprimé en conditions de culture normale. De plus, ΔacrA et ΔmdtAΔacrA étaient moins virulents que la « WT » après injection à des larves de Spodoptera littoralis tout en étant aussi résistants que la « WT » aux peptides antimicrobiens naturellement produits par l’insecte.Ensuite, nous nous sommes intéressés à étudier l’implication de la pompe AcrAB dans la « self-resistance » chez P. laumondii TT01. D’une manière intéressante, nous avons observé que la « WT » exerce une activité antimicrobienne contre son mutant acrA alors que ce dernier n’a présenté aucune activité antimicrobienne contre lui-même. De plus, Les essais de compétition in vitro ont révélé que ΔacrA est moins compétitif que la « WT ». Nous avons aussi démontré par des essais de détermination des concentrations minimales inhibitrices que ΔacrA était plus sensible que la « WT » aux stilbènes. En parallèle les analyses d’HPLC-MS ont montré que ΔacrA présente des quantités beaucoup moindres de stilbènes dans son surnageant que la « WT ». D’autre part, nous avons démontré que la présence des pigments d’anthraquinone dans le surnageant de ∆acrA a été réduite par rapport à la « WT », ce qui explique la faible pigmentation de ses colonies par rapport à celles de la « WT » typiquement teintées en jaune.Enfin, nous avons investigué l’implication de la pompe AcrAB dans la survie de P. laumondii TT01. Les résultats du suivi de la survie des souches marquées de la WT et ∆acrA dans le cadavre de l’insecte ont montré qu’AcrAB n’est pas impliquée dans la survie chez P. laumondii TT01 en conditions de culture sans présence d’autres microorganismes.L’ensemble de ces résultats révèle l’effet pléïotrope de la pompe à efflux AcrAB chez P. laumondii TT01.