Clonación en plásmidos para la producción y secreción de péptidos o proteínas en Saccharomyces cerevisiae”

Universidad Nacional Agraria La Molina. Facultad de Ciencias. Departamento Académico de Biología

El presente trabajo tuvo como objetivo investigar la secreción de glutatión S-transferasa (GST) y oligopéptidos en Saccharomyces cerevisiae mediante la clonación de los respectivos genes en plásmidos. La clonación se realizó mediante la técnica denominada “in vivo”, y su correcta ejecución fue comprobada mediante PCR y posterior secuenciación. Los plásmidos construidos incluían las secuencias codificantes para dos tipos de péptidos señal: el PS-Alfa (derivado del factor de apareamiento alfa) y un PS-Sintético (diseñado a partir de secuencias de consenso derivadas de las proteínas Yps1/Yap3/TA57). La producción y secreción de GST fueron comprobadas mediante ensayos de Western blot, obteniendo como resultado la detección de bandas del tamaño esperado (26 kDa) y otras de mayor tamaño, dependiendo del péptido señal (PS) utilizado. A pesar de estas diferencias, las eficiencias de secreción observadas fueron similares. Sin embargo, la GST hallada intracelularmente para el caso del PS-sintético mostró mayor tamaño, sugiriendo una mayor cantidad de glicosilaciones. Posteriormente, se desarrolló un ensayo que permite comparar los efectos fotoprotectores de péptidos previamente identificados en nuestro laboratorio. Se evaluó la capacidad de supervivencia de las células transformadas con los plásmidos de secreción, sometiéndolas a irradiación UV. Los resultados sugieren una moderada capacidad fotoprotectora pero se requiere ampliar estos estudios. En conclusión, la maquinaria de recombinación homóloga de S. cerevisiae permite la óptima clonación de insertos para la construcción de plásmidos. La proteína GST puede ser secretada utilizando los péptidos señal PS-Alfa y PS-Sintético, pero este último causa un mayor número de modificaciones.

The main goal of this thesis was to investigate the secretion of glutathione S-transferase (GST) and a few oligopeptides in Saccharomyces cerevisiae by cloning the respective genes in plasmids. The constructed plasmids included also the sequences coding for two types of signal peptides (PS): “PS-Alpha”, derived from the alpha mating factor and “PS-Synthetic”, designed from the consensus sequences for the PSs of the Yps1/Yap3/TA57 proteins. All plasmids were assembled in vivo, and the inserts were verified by analytical PCR and then by nucleotide sequencing. GST production and secretion were verified by Western blot assays, resulting in the detection of bands of the expected size (26 kDa) and others of larger size, depending on the signal peptide (PS) used. Interestingly, while the secretion efficiencies observed were similar for both PSs, in the case of PS-Synthetic the GST found intracellularly showed larger sizes, suggesting a greater amount of glycosylations. Likewise, a simple assay was designed to compare the photoprotective effects of peptides previously identified in our laboratory. The survivability of the cells transformed with the secretion plasmids was evaluated by irradiating them with UV. The results suggest a moderate photoprotective capacity but it is necessary to expand these studies. In conclusion, the S. cerevisiae homologous recombination machinery allows optimal cloning of inserts for plasmid construction. The GST protein can be secreted by using the signal peptides PS-Alpha and PS-Synthetic, but the last causes a greater number of modifications.