Identification protéomique de nouvelles adhésines chez Escherichia coli entérohémorragique 0157 -- H7 dans une stratégie de prévention de la colonisation intestinale | Proteomic identification of novel adhesins in enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157 -- H7 in a strategy of preventing intestinal colonization

Английский. Shiga toxin-encoding Escherichia coli (STEC) regroup strains that carry genes encoding Shiga toxin (Stx). Among intestinal pathogenic E. coli, enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) constitute the major subgroup of virulent STEC. EHEC colonizes the large intestine and causes diarrhea, hemorrhagic colitis and in some cases, life-threatening hemolytic-uremic syndrome (HUS). The lack of an effective clinical treatment, sequelae after infection and mortality rate in humans, allied with high prevalence of antibiotic resistance make this pathogen as priority for the world health agencies. Initial adherence to host cells is the crucial and first step of the infection of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The attaching/effacing lesions are considered to be important in EHEC. However, although EHEC produce this lesion on animal mondels and cultured human cells, this phenotype has not been demonstrated on human intestinal mucosal surfaces. The aim of the present research work was to identify some novel adhesins in EHEC O157:H7 in a strategy for preventing intestinal colonisation. Rather than classical reverse vaccinology approach solely based on genomic analysis aiming at identifying potential antigen candidates based on the prediction of their subcellular location at the bacterial cell surface, the identification of candidates was here primarily based on subproteomic analysis. To investigate the cell surface proteome, an original approach based on the use of biotinylation reagents of different sizes was first developed. This method highlighted that protein labelling using biotinylation reagents of different sizes provides a sophisticated and accurate way to differentially explore the cell envelope proteome of lipopolysaccharidic diderm bacteria. Following the secrectome concept, three subproteomes were considered and characterised by relative quantification analysis, namely, the proteosurfaceome (proteome at the cell surface), exoproteome (proteome in the extracellular milieu) and proteovesiculome (proteome of the membrane vesicles). This secretome analysis revealed unique proteins expression depending on growth conditions and related to different secretion pathways from EHEC O157:H7, particularly Type III secretion system. Proteomics analysis was combined with functional protein characterisation to identify a group of proteins potentially involved in EHEC O157:H7 adhesion to extracellular matrix and to intestinal cell line. A group of outer membrane proteins revealed important role in the adherent phenotype of EHEC O157:H7 as well promoting bacterial aggregation. Moreover antibodies raised against selected recombinant proteins showed to effectively reduce the adhesion of EHEC to an intestinal cell model.

Французский. Les Escherichia coli producteurs de Shiga-toxine (STEC) contiennent des souches portant des gènes codant pour la toxine de Shiga (Stx). Parmi les souches d'E. coli pathogènes pour l'intestin, E. coli entérohémorragique (EHEC) est le plus grand groupe de STEC virulents. L'EHEC colonise le gros intestin et provoque des diarrhées, des colites hémorragiques et, dans certains cas, un syndrome hémolytique et urémique. L'absence de traitement clinique efficace, la présence de complications après l'infection et le taux de mortalité élevé chez l'homme, associés à la forte prévalence de la résistance aux antibiotiques, font de cet agent pathogène une priorité pour l'Organisation mondiale de la santé (OMS). L'adhésion aux cellules hôtes est le stade crucial de l'infection à Escherichia coli entérohémorragique (EHEC). Les lésions attaquantes sont considérées comme importantes pour l'EHEC. Cependant, bien que l'EHEC produise ces lésions dans des modèles animaux et sur des cellules humaines cultivées, ce phénotype n'a pas été mis en évidence à la surface de la muqueuse intestinale. Le but de ce travail de recherche est d'identifier de nouveaux adhésifs dans l'EHEC 0157:H7 pour prévenir la colonisation intestinale. Plutôt que l'approche classique de la vaccinologie inverse, axée uniquement sur l'analyse génomique pour identifier les antigènes candidats potentiels sur la base de la localisation subcellulaire susmentionnée à la surface de la bactérie, l'identification des candidats était initialement basée sur l'analyse subprotéomique. Pour étudier le protéome de la surface cellulaire, une approche originale a été développée, basée sur l'utilisation de réactifs biotinylés de différentes tailles. Cette méthode montre que la protéine étiquetée à l'aide de réactifs biotinylés de différentes tailles offre un moyen sophistiqué et précis d'explorer le protéome de surface des bactéries gram-négatives. En suivant le concept de sécrétome, trois sous-protéomes ont été considérés et caractérisés par une analyse quantitative et relative, appelés protéosurfaceome (protéome de surface cellulaire), exoprotéinome (protéome dans l'environnement extracellulaire) et protéovesiculome (protéome de la vésicule membranaire). Cette analyse du sécrétome a révélé l'expression de protéines dépendantes des conditions de croissance et les différents mécanismes de sécrétion dans l'EHEC 0157:H7, en particulier le système de sécrétion de type III. Les analyses protéomiques ont été combinées à la caractérisation fonctionnelle des protéines afin d'identifier un groupe de protéines potentiellement impliquées dans l'adhésion de l'EHEC 0157:H7 à la matrice extracellulaire ou aux lignées cellulaires intestinales. Un groupe de protéines de la membrane externe s'est avéré jouer un rôle important dans le phénotype adhésif de l'EHEC 0157:H7, favorisant également l'agrégation bactérienne. En outre, il a été démontré que les anticorps hélicoïdaux contre certaines protéines recombinantes réduisent efficacement l'adhésion des EHEC à un modèle de cellule intestinale.