Prospección y caracterización de bacterias celulolíticas y hemicelulolíticas

Tesis para obtener el grado de Doctor en Química Biológica, de la Universidad de Buenos Aires, en 2018

La prospección de bacterias con capacidad de degradar lignocelulosa permite la identificación de nuevas enzimas con potencial aplicación en numerosos procesos industriales. En este trabajo el objetivo fue la obtención de enzimas con aplicación potencial en la bioconversión de lignocelulosa, mediante la prospección de bacterias celulolíticas de suelos forestales nativos y estudiar sus mecanismos de deconstrucción de biomasa. Se obtuvieron consorcios bacterianos celulolíticos de dos localidades de Argentina (Cerro Bayo, Neuquén y Valle Grande, Mendoza). Los consorcios fueron caracterizados en cuanto a su actividad enzimática, siendo el consorcio CB1-2 el que presentó mayor actividad celulolítica relativa. A partir del mismo se logró el aislamiento de todos sus integrantes y uno de ellos, al que se denominó Paenibacillus sp. A59, resultó el principal responsable de la actividad estudiada, mientras que los aislamientos pertenecientes a los géneros Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp. y Bacillus sp. no presentaron actividad celulolítica detectable. Por técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS) se secuenció el genoma completo de Paenibacillus sp. A59 con una profundidad de 110 veces y se ensambló en 83 contigs. A partir del análisis del genoma con múltiples herramientas bioinformáticas, como las plataformas del NCBI, RAST y dbCAN, seguido de depuración manual, se identificaron 82 secuencias codificantes para potenciales proteínas activas sobre carbohidratos, incluyendo celulasas, xilanasas, mananasas, quitinasas y amilasas, entre otras. Además, se determinaron las condiciones óptimas para maximizar la actividad enzimática en el sobrenadante de cultivo, utilizando como fuente de carbono carboximetilcelulosa, xilano o residuo de cosecha de caña de azúcar, resultando predominante la actividad xilanasa en crecimiento con xilano. El estudio del secretoma en las diferentes condiciones de cultivo ensayadas, permitió identificar las proteínas responsables de dicha actividad y establecer un posible modelo para el sistema xilanolítico de esta bacteria. Entre las enzimas identificadas, dos endoxilanasas de las familias GH10 y GH11 involucradas en la deconstrucción de la hemicelulosa, fueron seleccionadas para ser expresadas de manera recombinante y caracterizar su actividad. Ambas enzimas se expresaron en el sistema de E. coli, de manera soluble y fueron purificadas a homogeneidad. Presentaron actividad óptima a temperaturas moderadas (entre 40 y 55°C) y a pHs cercanos al neutro, si bien rGH11XynB presentó también alta actividad a pH alcalino. Tanto rGH10XynA como rGH11XynB mostraron actividad xilanolítica sobre xilanos comerciales y sobre la fracción hemicelulolítica de biomasas pre-tratadas (trigo, cebada y maíz). Sin embargo, la cinética enzimática y el perfil de los productos de hidrólisis generados mostraron diferencias, lo que podría determinar su utilización en una variedad de procesos. Este estudio comprende un análisis detallado del aislamiento Paenibacillus sp. A59 y de sus enzimas activas sobre carbohidratos, contribuyendo así en la comprensión de los mecanismos microbianos involucrados en la bioconversión de polisacáridos y estableciendo las bases para su aplicación industrial.

Prospection of hemicellulose degrading bacteria allows the identification of novel enzymes with potential application in numerous industrial processes. The objective of this work was the obtention of enzymes with potential application in bioconversion of lignocellulose, by prospection of cellulolytic bacteria from native forest soils, and the study of their mechanisms of biomass deconstruction. We obtained cellulolytic bacterial consortia from forest soils, from two areas of Argentina (Cerro Bayo, Neuquén and Valle Grande, Mendoza). Enzymatic activity of the consortia was characterized, resulting CB1-2 the one with the highest relative cellulolytic activity. We isolated all the consortium components and one of them, Paenibacillus sp. A59, was the main one responsible for the assayed activity, while the isolates belonging to Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp. and Bacillus sp. did not present cellulolytic activity. By next generation sequencing (NGS) techniques, Paenibacillus sp. A59 genome was fully sequenced, with a 110-fold coverage, and assembled in 83 contigs. By genome analysis using multiple bioinformatic tools, such us NCBI, RAST and dbCAN pipelines followed by manual editing, 82 coding sequences for potential carbohidrate active enzymes were identified, including cellulases, xylanases, mannanases, chitinases and amylases, among others. Also, optimal conditions for achieving the highest enzymatic activity in culture supernatants were determined, using carboxymethylcellulose, xylan or sugarcane straw as carbon sources, resulting xylanase the main activity, by growth in xylan. Secretome study under the different culture conditions assayed, allowed to identify the main proteins responsible for the activity and to establish a possible model of the xylanolytic system of this bacterium. Among the enzymes identified, two endoxylanases from GH10 and GH11 families, involved in hemicellulose deconstruction, were selected for recombinant expression and activity characterization. Both enzymes were expressed in E. coli system in the soluble fraction and purified to homogeneity. They presented optimal activity at moderate temperatures (between 40°C and 55°C) and at neutral pH, and rGH11XynB showed also high activity at alkaline pH. rGH10XynA and rGH11XynB had xylanolytic activity on comercial xylans and on the hemicellulolytic fraction of pretreated biomasses (wheat, barley and maize). However, the enzyme kinetics and the hydrolysis products profiles showed differences, which could determine their utilization in a variety of processes. This study comprises a detailed analysis of Paenibacillus sp. A59 isolate and their carbohydrate active enzymes, contributing to the understanding of microbial mechanisms involved in polysaccharides bioconversion and setting the basis for industrial application.

Instituto de Biotecnología

Fil: Ghio, Silvina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina.