Análisis del microbioma de insectos: identificación y caracterización de glicosil hidrolasas

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en 2018

Algunos insectos han desarrollado estrategias muy eficaces para utilizar sustratos lignocelulósicos como fuentes de energía. En termitas y algunos coleópteros, la digestión de la lignocelulosa es el resultado de la acción coordinada de enzimas endógenas y las de sus endosimbiontes junto con la digestión mecánica. Esta característica los convierte en un recurso óptimo para la búsqueda de nuevas enzimas lignocelulolíticas. En este contexto, el objetivo general de este trabajo consistió en el estudio y prospección de la diversidad bacteriana, cultivable y no cultivable, presente en el intestino de termitas nativas y coleópteros, así como la caracterización de enzimas hidrolíticas y su utilización en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica. Por un lado, se exploró la diversidad bacteriana de los endosimbiontes celulolíticos cultivables y se evaluó la actividad (hemi) celulolítica de bacterias cultivables y de los extractos intestinales de dos termitas nativas argentinas, con hábitos alimenticios diferentes, Nasutitermes aquilinus (madera) y Cortaritermes fulviceps (suelo). Se obtuvo información acerca de la microbiota asociada con capacidad de degradar celulosa en cada termita. A su vez, mediante espectrometría de masas, se logró identificar varios péptidos, posiblemente involucrados en la degradación de hemicelulosa, con similitud a xilanasas. Al centrarnos en estas especies neotropicales menos estudiadas, intentamos descubrir nuevas fuentes biológicas de enzimas con posibles aplicaciones en biocombustibles. Además, se estudió de qué manera el microbioma del coleóptero Anthonomus grandis boheman responde a cambios en la dieta y cómo se modifican las actividades hidrolíticas en el intestino de larvas alimentadas con diferentes sustratos lignocelulósicas. Para ello, se alimentaron larvas de A. grandis con tres dietas artificiales diferentes: harina de algodón, pasto elefante y rastrojo de maíz. Mediante secuenciación de nueva generación (NGS) de la región hipervariable V3-V4 del gen de ARN ribosomal 16S, se estudiaron los cambios en la estructura y diversidad bacteriana del intestino del insecto. A partir de estos estudios se observó que los cambios producidos en la dieta influyen en la composición de la comunidad microbiana presente en el intestino, pudiéndose identificar un core microbiano entre las tres dietas. Estos resultados sugieren que los cambios en la abundancia de la microbiota degradadora de celulosa influyen sobre la actividad celulolítica general. A partir de datos provenientes del análisis metagenómico del intestino de la termita N. aquilinus, se seleccionaron seis genes codificantes para las enzimas glicosil hidrolasas más abundantes, pertenecientes a la familia 5. Dos de ellos, GH5CelA y GH5CelB, se expresaron en el sistema de Escherichia coli de manera soluble y las proteínas fueron purificadas a homogeneidad. Ambas enzimas presentaron actividad sobre los sustratos pNPC y β-glucano de cebada; GH5CelB mostró también actividad sobre Carboximetilcelulosa. La actividad enzimática óptima de ambas se detectó a temperaturas moderadas (entre 35 y 50 °C) y pH 5. Las enzimas mostraron diferencias en la cinética y el perfil de los productos de hidrólisis generados. Los resultados de esta tesis contribuyen a la caracterización de los procesos celulolíticos de los insectos y a la identificación y caracterización de enzimas degradadoras de celulosa con potencial aplicación en la industria del bioetanol y otros procesos biotecnológicos.

Some insects have developed very effective strategies to use lignocellulosic substrates as energy sources. In termites and some Coleoptera, olignocellulose digestion is the result of the coordinated action of endogenous enzymes and enzymes of their endosymbionts together with mechanical digestion. This characteristic makes them an optimal target for the search of new lignocellulolytic enzymes. In this context, the general objective of this work consisted of the study and prospecting of the bacterial diversity, cultivable and non-culturable, present in the gut of native termites and Coleoptera by characterizing hydrolytic enzymes and their use in the hydrolysis of lignocellulosic biomass. First, we explored the diversity of culturable cellulolytic bacterial endosymbionts and subsequently evaluated the (hemi) cellulolytic activity of culturable bacteria from gut extracts of two Argentinean native termites with different feeding habits, Nasutitermes aquilinus (wood) and Cortaritermes fulviceps (soil). This approach helped us gather novel information about the microbiota associated with the ability to degrade cellulose in each of the tested termites. By focusing on these less studied neotropical species, we aimed to discover new biological sources of enzymes with possible applications in biofuels. Furthermore, mass spectrometry was used to identify several peptides, possibly involved in the degradation of hemicellulose, with similarity to xylanases. In addition, we examined how the weevil Anthonomus grandis boheman microbiome responds to changes in diet and how its cellulosic activities were modified by this microbiome. We performed a screening by next-generation sequencing (NGS) of bacterial communities present in the gut of A. grandis fed with three different lignocellulosic feedstocks (cottonseed meal, elephant grass, and corn stover). We sequenced amplicons covering the V3-V4 region of the 16S rRNA genes and complemented this data with a characterization of hydrolytic activities for each of the three diets. From these studies, we observed that the changes produced in the diet influence the composition of the microbial community present in the gut. We were able to identify a microbial core among the three diets. These results would indicate that changes in the abundance of the cellulose degrading microbiota would influence the general cellulolytic activity. Six genes encoding the most abundant glycosyl hydrolase enzymes, belonging to family 5, were selected from the metagenomic analysis of the gut of the termite N. aquilinus. Two of them, GH5CelA and GH5CelB, were expressed in Escherichia coli system in the soluble fraction and purified to homogeneity. Both enzymes showed activity on pNPC and barley β-glucan substrates but only GH5CelB showed activity on CMC. Both enzymes presented optimal activity at moderate temperatures (between 35 and 50 °C) and at pH 5. However, the kinetics and the hydrolysis products profiles of the enzymes differed. The results on this thesis contribute to the characterization of the cellulolytic processes in insects and to the identification and characterization of cellulose degrading enzymes with potential application in the bioethanol industry and other biotechnological applications.

Instituto de Biotecnología

Fil: Ben Guerrero, Emiliano. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina