Estandarización del método PMAxxTM qPCR para la cuantificación de la carga viable de Salmonella spp. en contenido cecal de origen avícola

Actualmente, la estandarización y validación de técnicas moleculares cuantitativas como la qPCR son importantes para los sectores de aseguramiento de calidad e investigación. Especialmente, es imprescindible la estandarización de protocolos de qPCR para la detección de Salmonella spp., por el impacto que causa en la salud de la población. El presente trabajo tuvo como objetivo estandarizar el método de qPCR basado en PMAxxTM para la detección y cuantificación de células viables de S. Infantis en muestras de contenido cecal de origen avícola. Primero, se realizó la tinción con el tinte de viabilidad bacteriana PMAxx (Trademark) de las muestras de cultivo puro de Salmonella, para inhibir la señal de células no viables. Luego de la extracción de ADN con dos kits distintos, se realizó un banco de diluciones seriadas, las cuales fueron usadas para la construcción de curvas estándar mediante el Termociclador Illumina Eco (Trademark) Real-Time PCR System. En el análisis de los resultados, la concentración y volumen de tinte usado, inhibió significativamente la señal de las células muertas. Las curvas estándar obtenidas con los dos kits de extracción de ADN presentaron una alta linealidad mayor a 0,99 y con un límite de cuantificación de Ct 31,4. No obstante, la mejor eficiencia se la obtuvo con el QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit, que fue de 84,99 porciento. Por lo tanto, se utilizó la optimización del método obtenida con este kit por tener valores de rendimiento aceptables para la posterior cuantificación de S. Infantis en muestras de contenido cecal de origen avícola.

Currently, the standardization and validation of quantitative molecular techniques such as qPCR are important for the quality assurance and research sectors. Especially, the standardization of qPCR protocols for the detection of Salmonella spp. is essential, due to the impact it has on the health of the population. The present work aimed to standardize the PMAxxTM-based qPCR method for the detection and quantification of viable cells of S. infantis in poultry cecal content samples. First, staining with PMAxx bacterial viability stain (Trademark) of pure Salmonella culture samples was performed to inhibit the signal of non-viable cells. After DNA extraction with two different kits, a bank of serial dilutions was made, which were used for the construction of standard curves using the Illumina Eco Thermal Cycler (Trademark) Real-Time PCR System. In the analysis of the results, the concentration and volume of dye used significantly inhibited the signal of dead cells. The standard curves obtained with the two DNA extraction kits showed a high linearity greater than 0.99 and a limit of quantification of Ct 31.4. However, the best efficiency was obtained with the QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit, which was 84.99 percent. Therefore, the optimization of the method obtained with this kit was used because it had acceptable yield values for the subsequent quantification of S. infantis in samples of poultry cecal contents.