Detecção e descontaminação de Mycoplasma spp. em cultivos celulares e cepas virais | Detection and decontamination of Mycoplasma spp. in cell cultures and viral strains

Mycoplasma spp. are bacteria belonging to the class Mollicutes, considered the smallest organisms capable of self-replication (0.15 – 0.3 μm) and lacking a defined cell wall. They are associated with infections in animals and humans and are frequent contaminants of cell cultures and biological products. This high frequency is because these microorganisms are resistant to most antimicrobials used in cell cultures, do not cause observable changes under the light microscope in cultures, and often go undetected by conventional tests. However, mycoplasma contamination of cell cultures can interfere with various aspects of cellular physiology and metabolism, thus affecting the results and quality of products obtained from these cultures. Therefore, the present study aimed to investigate Mycoplasma spp. contamination in cell cultures and viral strains used in the Virology Sector of the Federal University of Santa Maria and once detected, to evaluate drugs and decontamination protocols. Among 25 cell lines and primary cultures tested for Mycoplasma spp. by PCR, 16/25 (64%) were positive, and regarding viral strains, 13/13 (100%) were contaminated, including three of bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1), two of BVDV-2, one of HoBi-like virus (HobiPeV), four of bovine herpesvirus 1 (BoHV-1), one of BoHV-2, BoHV-5, and bovine parainfluenza virus 3 (PI-3V). Next, Plasmocin® [P] and gentamicin [G] were tested alone or in combination for the decontamination of bovine (MDBK and CRIB), porcine (PK-15), rabbit (RK-13), and hamster (BHK-21) cell lines. These five cultures were subjected to the decontamination protocol and tested weekly for Mycoplasma spp. via PCR. Decontamination was only possible after 35 days of treatment, with the combined treatment P + G being effective in eliminating Mycoplasma spp. from three lines (PK-15, BHK-21, and RK-13) with 35 days of treatment, and in the MDBK line with 42 days. Treatment with Plasmocin® alone decontaminated the RK-13 line with 35 days of treatment, and the MDBK line with 42 days. However, treatment with gentamicin alone was only effective in decontaminating the RK-13 line after 35 days of treatment. One cell line (CRIB) could not be decontaminated even after 70 days of combined treatment with P + G. Contamination in batches of bovine fetal serum (BFS) was also investigated, with all 12 commercial batches tested negative for Mycoplasma spp. via PCR. Subsequently, the viral strain decontamination protocol was performed. This protocol involved cycles of viral amplification in cell culture, suspension centrifugation (14,000 RPM for 15 min.), filtration (0.1 or 0.22 μm), limiting dilution, and cultivation in Mycoplasma spp.-free cells in the presence of P + G. The 13 viral strains were successfully decontaminated after 1 to 4 decontamination cycles. Thus, the present study detected the frequent contamination of cell cultures and viral strains with Mycoplasma spp. and successfully performed the decontamination of these biological inputs. Keywords: contamination, cell cultures, mycoplasma, virus, decontamination.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Os Mycoplasma spp. são bactérias pertencentes à classe dos Mollicutes, considerados os menores organismos com capacidade de autorreplicação (0,15 – 0,3 μm) e sem parede celular definida. São associados com infecções em animais e humanos, e se constituem em frequentes contaminantes de cultivos celulares e produtos biológicos. Essa alta frequência se deve ao fato de que esses microrganismos são resistentes à maioria dos antimicrobianos utilizados em cultivos celulares, não causam alterações passíveis de observação ao microscópio ótico nos cultivos e, muitas vezes, não são detectados por testes convencionais. No entanto, a contaminação de cultivos celulares por micoplasmas pode interferir em vários aspectos da fisiologia e metabolismo celular e, assim, interferir com os resultados e qualidade dos produtos obtidos a partir desses cultivos. Assim, o presente trabalho teve como objetivos investigar a contaminação por Mycoplasma spp. em cultivos celulares e cepas virais utilizadas no Setor de Virologia da Universidade Federal de Santa Maria e, uma vez detectada, avaliar drogas e protocolos de descontaminação. Dentre 25 linhagens celulares e cultivos primários testados para Mycoplasma spp. por PCR, 16/25 (64%) foram positivos, e quanto as cepas virais, 13/13 (100%), estavam contaminadas, sendo três de vírus da diarreia viral bovina 1 (BVDV-1), duas de BVDV-2, uma de HoBi-like virus (HobiPeV), quatro de herpesvírus bovino 1 (BoHV-1), uma de BoHV-2, BoHV-5 e vírus da parainfluenza bovina 3 (PI-3V). A seguir, Plasmocin® [P] e gentamicina [G] foram testadas isoladamente ou em conjunto, para a descontaminação de linhagens celulares de bovinos (MDBK e CRIB), suíno (PK-15), de coelho (RK-13) e de hamster (BHK-21). Esses cinco cultivos foram submetidos ao protocolo de descontaminação e testados semanalmente para Mycoplasma spp. através de PCR. A descontaminação só foi possível a partir de 35 dias de tratamento, sendo que o tratamento combinado P + G foi efetivo em eliminar o Mycoplasma spp. de três linhagens (PK -15, BHK – 21 e RK -13) com 35 dias de tratamento, e na linhagem MDBK com 42 dias. O tratamento somente com Plasmocin® descontaminou a linhagem RK – 13 com 35 dias de tratamento, e a MDBK com 42 dias. Já o tratamento com a gentamicina isolada somente foi efetivo em descontaminar a linhagem RK – 13 a partir de 35 dias de tratamento. Uma linhagem celular (CRIB) não pode ser descontaminada mesmo após 70 dias de tratamento combinado P + G. Também foi investigada a contaminação em lotes de soro fetal bovino (SFB), sendo que dos 12 lotes comerciais testados, todos deram negativos para Mycoplasma spp. através de PCR. A seguir realizou-se o protocolo de descontaminação das cepas virais. Esse protocolo consistia em ciclos de amplificação viral em cultivo celular, centrifugação da suspensão (14,000 RPM por 15 min.), filtração (0,1 ou 0,22μm), diluição limitante e cultivo em células livres de Mycoplasma spp. na presença de P + G. As 13 cepas virais foram descontaminadas com sucesso após 1 a 4 ciclos de descontaminação. Assim, o presente trabalho detectou a contaminação frequente de cultivos celulares e cepas virais com Mycoplasma spp. e realizou, com sucesso, a descontaminação desses insumos biológicos.