Morphophysiology and 20-hydroxyecdysone production in Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen in response to CO2-enrichment and drought stress | Morfofisiologia e produção de 20-hidroxiecdisona em Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen em resposta à atmosfera enriquecida com CO2 e estresse hídrico

Anthropogenic activities have been catalyzing climate changes, owing to increased atmospheric carbon dioxide concentration ([CO 2 ]). In respect to CO 2 , its general effects on the regulation of plant growth, development and metabolism are widely explored, especially in agricultural crops. However, the changes in medicinal species under elevated [CO 2 ] are still poorly understood. Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, a plant species native to Brazil and popularly known as Brazilian ginseng, stands out by the production of 20-hydroxyecdysone (20E), a phytoecdysteroid molecule with proven therapeutic and nutraceutical activities in mammals. Previous findings from our research group revealed that in vitro CO 2 -enrichment led to physiological changes in P. glomerata. We hypothesize that CO 2 -enrichment affects the production of primary and secondary metabolites, such as 20E, in P. glomerata. Therefore, the objective here was to evaluate the effect of the CO 2 -enriched atmosphere on morphophysiological, biochemical, structural, molecular aspects, as well as in water deficit tolerance responses. For this, two independent experiments were conducted in open top chambers (OTCs). For both experiments, clonally micropropagation-derived plantlets from the in vitro germplasm bank were used. In experiment I, we assessed the influence of two CO 2 concentrations: ambient (a[CO 2 ], ± 400 µmol mol -1 CO 2 ) and elevated (e[CO 2 ] ± 800 µmol mol -1 CO 2 ). After approximately 21 days of cultivation in OTC, our data showed that e[CO 2 ] increased photosynthesis (A N ), and water use efficiency (WUE), biomass accumulation, photosynthetic pigments, carbohydrate content, expression of genes of the lignin biosynthetic pathway, and induced changes in the proteomic profile. On the other hand, e[CO 2 ] promoted reduction in total protein, amino acids and 20E contents. In experiment II, the physiological and biochemical responses of plants exposed to combined e[CO 2 ] and under water deficit were analyzed. During the first 14 days of cultivation, all plants were regularly irrigated to maintain soil water at field capacity. Then, the plants were subjected for 21 days to the following treatments: (I) a[CO 2 ] and well-watered (a[CO 2 ]WW); (II) e[CO 2 ] and well- watered (e[CO 2 ]WW); (III) a[CO 2 ] and drought stressed (a[CO 2 ]D); and (IV) e[CO 2 ] and drought stressed (e[CO 2 ]D). Our data demonstrate that e[CO 2 ] mitigates drought impacts by reducing stomatal conductance (g S ), improving WUE, and promoting less negative water potentials. Although the reduction in gs decreased water loss by evapotranspiration, it negatively affected A N , and consequently plant growth. Hyperspectral analysis corroborates these findings and is a great non-destructive tool to analyse the effects of drought on plants. We found that P. glomerata exhibits different drought response mechanisms depending on [CO 2 ]. Plants exposed to a[CO 2 ]D increased root/shoot ratio, stem rustification, non- enzymatic antioxidant system by increased anthocyanin content and proteins of ascorbate and glutathione metabolism. Conversely, plants under e[CO 2 ]D invested strongly in osmoregulatory metabolites (e.g. soluble sugars and amino acids). We found that e[CO 2 ] associated to drought promoted changes in the proteomic profile, dramatically affecting the accumulation of stress response proteins. On the other hand, we show that drought positively affected the activity of antioxidant enzymes (CAT and SOD) and 20E content in both [CO 2 ] in P. glomerata plants. However, only in plants exposed to e[CO 2 ]D was there an increase in 20E production, overcoming the biomass limitation caused by this stress. Here, we report for the first time, the up-regulation of cytochrome P450 CYP72A219-like protein in plants grown in the combination e[CO 2 ]D. Therefore, we hypothesize a relationship of this protein with 20E biosynthesis and hypothesize possible ROS signaling (indirectly by increased CAT and SOD) under abiotic stress condition. These data provide relevant information in elucidating the pathway of 20E biosynthesis, as well as enabling biotechnological strategies to increase the production of this metabolite in P. glomerata plants. Keywords: Brazilian ginseng. 20-hydroxyecdysone. Phytoecdysteroids. Water stress. CO 2 enrichment. Secondary metabolism.

Atividades antrópicas têm vindo a provocar alterações climáticas, tais como o aumento da concentração atmosférica de dióxido de carbono ([CO 2 ]). Em relação ao CO 2 , os seus efeitos gerais na regulação do crescimento, desenvolvimento e metabolismo das plantas são amplamente explorados, especialmente nas culturas agrícolas. No entanto, essas alterações nas espécies medicinais sob [CO 2 ] elevado ainda são mal compreendidas. Entre as espécies de interesse fitoterápico, destaca-se a Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, planta nativa do Brasil e popularmente conhecida como ginseng-brasileiro. As suas propriedades medicinais devem-se principalmente à produção do metabólito secundário 20-hidroxiecdisona (20E), um fitoecdisteroide com comprovadas atividades terapêutica e nutracêutica em mamíferos. Estudos do nosso grupo de pesquisa têm revelado que o enriquecimento da [CO 2 ] in vitro leva à alterações fisiológicas em P. glomerata. Levantamos a hipótese de que o enriquecimento da [CO 2 ] afeta a produção de metabólitos primários e secundários, como o 20E, na espécie-alvo. Portanto, avaliamos o efeito da elevada [CO 2 ] (e[CO 2 ]) nos aspectos morfofisiológicos, bioquímicos, estruturais e moleculares, bem como nas respostas de tolerância ao estresse hídrico. Para tal, foram realizados dois experimentos independentes em câmaras de topo aberto (CTA). Para ambos os experimentos, foram utilizadas plântulas derivadas da micropropagação clonal a partir do banco de germoplasma in vitro. No experimento I, foi analisado a influência de duas concentrações de CO 2 : ambiente (a[CO 2 ]) ± 400 µmol mol -1 ) e elevada (e[CO 2 ]) ± 800 µmol mol -1 ). Após aproximadamente 21 dias de cultivo em OTC, os nossos dados mostraram que a e[CO 2 ] afetou positivamente a fotossíntese (A N ) e uso eficiente da água (WUE), o acúmulo de biomassa, os pigmentos fotossintéticos, o conteúdo de carboidratos, genes da rota de biossíntese de lignina, além de promover alterações no perfil proteômico. Por outro lado, a e[CO 2 ] promoveu redução no teor de proteínas totais, de alguns aminoácidos e do conteúdo de 20E. No experimento II, foram analisadas as respostas fisiológicas e bioquímicas de plantas expostas a e[CO 2 ] e sob estresse hídrico. Durante os 14 dias iniciais do experimento, todas as plantas foram regularmente irrigadas para manter o conteúdo de água do solo próximo da capacidade do campo. Posteriormente, as plantas foram submetidas por 20 dias aos seguintes tratamentos: (I) a[CO 2 ] e sob irrigação regular (a[CO 2 ]I); (II) e[CO 2 ] e sob irrigação regular (e[CO 2 ]I); (III) a[CO 2 ] e sob estresse hídrico (a[CO 2 ]S); e (IV) e[CO 2 ] e sob estresse hídrico (e[CO 2 ]S);. Os nossos dados demonstraram que a e[CO 2 ] alivia os impactos da seca através da redução da condutância estomática (g S ), melhorando o WUE e promovendo potenciais hídricos menos negativos. Embora a redução da gs tenha favorecido a economia de água, ela afetou negativamente a A N , e consequentemente o crescimento das plantas. A análise hiperespectral corrobora com estes achados, sendo uma ótima ferramenta não destrutiva para analisar os efeitos da seca nas plantas. Descobrimos que P. glomerata apresenta diferentes mecanismos de resposta à seca dependendo da [CO 2 ]. Plantas expostas a a[CO 2 ]S investiram no aumento da razão raiz/parte aérea, na rustificação do caule, no sistema antioxidante não enzimático, pelo aumento no teor de antocianina e proteínas do metabolismo do ascorbato e glutationa. Enquanto que as plantas sob e[CO 2 ]S investiram em metabólitos osmorreguladores (e.g. açúcares solúveis e aminoácidos). Verificamos que a e[CO 2 ] promoveu alterações no perfil proteômico, afetando drasticamente o acúmulo de proteínas de resposta ao estresse. Por outro lado, mostramos que a seca promoveu aumento na atividade de enzimas antioxidantes (CAT e SOD) e o conteúdo 20E em ambas as [CO 2 ] em plantas de P. glomerata. Porém, somente nas plantas expostas a e[CO 2 ]S houve aumento da produção de 20E, superando a limitação de biomassa causada por esse estresse. Aqui, relatamos pela primeira vez, a regulação positiva da proteína cytochrome P450 CYP72A219-like em plantas cultivadas na combinação e[CO 2 ] e seca. Portanto, acreditamos em uma relação dessa proteína com a biossíntese de 20E e supomos uma possível sinalização de ROS (indiretamente pelo aumento de CAT e SOD) na produção de 20E em condição de estresse abiótico. Por fim, nossos dados fornecem informações importantes na elucidação da rota de biossíntese de 20E, além de possibilitar estratégias biotecnológicas para aumentar a produção desse metabólito em plantas de P. glomerata. Palavras-chave: Ginseng-brasileiro. 20-hidroxiecdisona. Fitoecdisteroides. Estresse hídrico. enriquecimento de CO 2 . Metabolismo secundário.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior