Morfogênese in vitro e transformação genética de citros mediada por Agrobacterium tumefaciens | Morphogenesis in vitro and Agrobacterium tumefaciens- mediated genetic transformation of citrus

Os protocolos utilizados para transformação genética de citros têm resultado numa baixa eficiência de transformação, com obtenção de pequeno número de plantas transgênicas, além de utilizarem material juvenil como fonte de explantes necessitando de um longo período para frutificação e conseguinte avaliação de uma característica de interesse introduzida. Um protocolo ideal para a transformação de citros seria baseado na utilização de tecido adulto como fonte de explantes, que reduziria o longo período de juvenilidade, e abreviria o tempo para a análise da característica transgênica incorporada. O objetivo inicial do presente trabalho foi o estabelecimento de um sistema de regeneração in vitro a partir de segmentos internodais de plantas adultas de três variedades de laranja doce (Citrus sinensis L. Osb.) e limão Cravo (Citrus limonia Osb.), visando à otimização da metodologia de transformação. Para a indução de organogênese, investigamos diferentes meios de cultura associados a reguladores de crescimentos (BAP e ANA) e antibióticos β- lactâmicos (timentim, cefotaxima, meropenen e augmentina), utilizados na supressão do crescimento bacteriano e na resposta morfogênica de tecidos adultos de C. sinensis e C. limonia. Demonstrou-se que a indução in vitro de brotações em tecidos adultos de citros foi afetada pelo genótipo, reguladores de crescimento, formulação do meio e a pela incorporação de antibióticos no meio de cultura. Além disso, foram adequados protocolo otimizados para a transformação genética de segmentos de epicótilo e cotilédones imaturos via Agrobcaterium tumefaciens. Para a otimização do protocolo envolvendo explantes provenientes de segmentos de epicótilo, alguns fatores foram investigados, como; o uso de sonicação, infiltração a vácuo e sonicação associada com infiltração a vácuo, comparando-se ao método tradicional de transformação envolvendo Agrobacterium (co- cultivo ou imersão na solução bacteriana) durante o co- cultivo de explantes de laranja doce Pineapple , e citrumelo Swuingle . A utilização de sonicação por 2 segundos, seguidos por 10 minutos de infiltração a vácuo, teve efeito positivo na eficiência de transformação (8.4%) para laranja Pineapple . Para citrumelo Swuingle a eficiência de transformação também foi aumentada com a combinação de sonicação e infiltração a vácuo (9,6%), mas não foi suficiente para obter uma percentagem maior que a utilização somente da metodologia tradicional de co-cultivo, com eficiência de transformação de 11,2%. Finalmente, estudou- se fatores que pudessem influenciar o processo de indução da morfogênese e a eficiência de transformação em cotilédones imaturos de grapefruit Duncan . Para a indução da organogênese a combinação de 2 mg l-1 BAP, 1 mg l-1 KIN and 1 mg l-1 AIA promoveu a maior freqüência de cotilédones produzindo brotações (96%) e número de brotações por explante (5,8), utilizando explantes cultivados dorsalmente em contato com o meio de cultura por 3 semanas no escuro, seguido por mais 3 semanas em regime de 16/8 horas (luz/ escuro). Os parâmetros analisados para aumentar a eficiência de transformação mediada por Agrobacterium resultaram em uma alta eficiência de transformação obtida quando os expantes foram submetidos a 15 minutos de infiltração a vácuo em presença da Agrobacterium (OD600nm 0,5), co- cultivados por 3 dias em meio contendo 100 μM de acetoseringona e transferidos para meio de seleção, constituído do meio MS contendo 30 mg l-1 de canamicina, 12,5 mg l-1 de meropenen, 2 mg l-1 BAP, 1 mg l-1 KIN and 1 mg l-1 AIA.

Current protocols used for citrus genetic transformation have resulted in a low number of transgenic plants, furthermore, it used juvenile material which source of explants. Plants regenerated from these sources of explants have long juvenile periods for initial fruit production and are necessary many years for evaluation of the introduced characteristics of interest in the target plant. A reliable and ideal protocol for citrus plant transformation would be based on the use of mature tissue as sources of explant, because the juvenility problem could be lessened and the transgenic trait could be analyzed in a relatively short period of time. Therefore, the initial objective of the present work was to establish promotive conditions for a reliable in vitro regeneration system from internodal segments of mature tissue of sweet orange and rangpur lime to further adequate an efficient and reproducible transformation methodology. For organogenesis induction, we investigated the effects of different culture media associated, growth regulator (BAP and NAA) and β-lactams antibiotics, (timentim, cefotaxime, meropenen and augmentin) on the morphogenic response from mature tissue of Citrus sinensis and C. limonia. We have demonstrated that in vitro shoot induction from mature tissue of Citrus was affected mainly by the genotype, growth regulators, media formulation and antibiotics incorporated to the culture medium. Furthemore, an improved protocol for genetic transformation of epicotyl and immature cotyledons were developed via Agrobacteirum tumefaciens. For protocol involving epicotyl explants some factors were investigated, such as: the use of sonication, vacuum infiltration and sonication in association with vacuum infiltration, comparing with conventional Agrobacterium-mediated transformation method ( dipping method) during cocultivation of Pineapple sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) and citrumelo Swingle (Citrus paradisi Macf. X Poncirus trifoliate L. Raf.) explants. The use of sonication for 2 seconds, followed by 10 minutes of vacuum infiltration had a positive effect on putative transgenic efficiency, resulting in the highest transformation efficiency (8.4%) for Pineapple sweet orange. For citrumelo Swingle the transformation efficiency also was enhanced with the combination of sonication and vacuum infiltration (9.6%), however power than the highest scores reached by ordinary co-cultivation protocol, which rended a transformation efficiency of 11.2%. Finally, we studied factors that might influence morphogenesis and Agrobacterium-mediated transformation efficiency of immature cotyledons from Duncan grapefruit . For organogenesis induction, the combination of 2 mg l-1 BAP, 1 mg l-1 KIN and 1 mg l-1 IAA led to the highest frequency of cotyledons forming shoots (96%) and number of shoots per explant (5.8), using explants cultured upside down for 3 weeks in the darkness, followed by 3 weeks in 16/8 h (light/dark) regime. Thus, optimization of Agrobacterium-mediated parameters showed that the highest transformation efficiency was achieved when explants were submitted to vacuum infiltration (15 min) in presence of agrobacteria (OD600nm 0.5); co- cultivation for 3- days on 100 μM acetoseryngone- supplemented medium; and finally transferred to a selective MS-based medium, added with 30 mg l-1 kanamycin, 12.5 mg l-1 de Meropenen®, 2 mg l-1 BAP, 1 mg l-1 KIN and 1 mg l-1 IAA.

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