Diversity of mycorrhizal fungi and carbon nutrition in tropical epiphytic orchids | Diversidade de fungos micorrízicos e nutrição por carbono em orquídeas epífitas tropicais

Orchids, in the nature, depend on the interaction with mycorrhizal fungi to complete the life cycle. At the center of the interaction, different fungi are involved which promote the exchange of compounds, mainly carbon, with the host orchid. However, the diversity of mycorrhizal fungi, mainly those belong to Tulasnellaceae, the commonest family of orchid mycorrhizal fungus, as well as the carbon flux in tropical epiphytic orchids are still little known. We investigated if there is the occurrence of this fungal family in the root of epiphytic tropical orchids as well as in the phorophyte bark where they occur, and if along the phorophyte there is difference in the carbon flux between the fungus and the orchid. Grids were used for sampling in two phorophytes, with five individuals of Isochilus linearis (Jacq.) R.Br. in each. Samples were collected from all roots of the orchids and also from the bark of the phorophyte just below the orchids roots, as well as from the bark of the phorophytes. After extraction of total DNA, PCR was performed with the primers for fungi in general (ITS86F + ITS4) and specifically for Tulasnellaceae (ITS86F + ITS4-Tul). The amplicons were sequenced by NGS (Next Generation Sequencing) by the Ion TorrentTM platform. The data were analyzed and the sequences identified in the lowest possible taxonomic level. The data were also submitted to ANOVA, and diversity indices and artificial neural networks (ANN) were analyzed. To evaluate the carbon flux, orchid metabolism (C3 or CAM), as well as the strategy of acquiring carbon by the orchid (mycoheterotrophic - MH, autotrophic - AT or mixotrophic - MT), we sampled leaves of orchid, non-orchids species and pelotons present in the roots of the orchids, growing in different height of phorophytes. The samples were dried to constant mass, ground and the 13 C/12C isotopic ratio measured by isotope ratio mass spectrometer. The isotopic signatures data were submitted to ANOVA, cluster analysis and ANN. It was observed the general fungi and also of the family Tulasnellaceae (42.38%) in different types of samples, mainly a species not yet described, Tulasnella sp. 3. Tulasnellaceae has been shown to be the key to diversity in I. linearis, as well as in associated phytophytes. The presence of fungi previously described in associations with lichens (Pectenia plumbea, Biatora ligni-mollis and Bacidia laurocerasi) suggests a “bridge” for the entry of N in the mycorrhizal association. In addition, two fungi with high prevalence (Candida smithsonii and Fusarium buharicum) have been described in intestinal tract of Coleoptera. This fact suggests that herbivory can be a tool for dispersion of these fungi. No patterns of mycorrhizal fungus dependence were observed by the orchid and altimetry gradient, although carbon flow was observed, and 11.11% of the orchids presented CAM. The orchids were MH, AT and MT, with prevalence of 63.64%, 22.72% and 13.64% respectively. Among three MT samples, two received more C from photosynthesis than from the associated mycorrhizal fungus. The climatic characteristics of the collection site, such as the constant presence of fog, may explain the low prevalence of orchids with CAM type, and because it is a dense forest, no difference was observed in the carbon flux, since it was expected that orchids in higher positions, would receive more light and would less dependent on mycorrhizal fungi. This is the first record of Tulasnellaceae in phorophytes bark and the carbon flux in tropical epiphytic orchids. The information generated in this study can provide subsidy for the elaboration of more efficient management plans, in which areas with occurrence of fungi potentially forming orchid mycorrhiza may be able to sustain the permanence of the species.

As orquídeas, no ambiente natural, dependem da interação com fungos micorrízicos para completar o ciclo de vida. No cerne da interação, estão envolvidos diferentes fungos que fazem a troca de compostos, principalmente carbono, com a orquídea hospedeira. Contudo, a diversidade de fungos micorrízicos, principalmente da família de fungos mais comumente encontrada em pesquisas com orquídeas brasileiras, a Tulasnellaceae, bem como o fluxo de carbono em orquídeas tropicais epífitas são ainda pouco conhecidos. Assim, investigamos (1) se há ocorrência dessa família na raiz de orquídeas tropicais epífitas e também na casca do forofito onde estão presentes e, se (2) ao longo dele, há diferença no fluxo de carbono e tipo de metabolismo (C3 ou CAM) entre o fungo e a orquídea. Grids foram utilizados para a amostragem em dois forófitos, contendo em cada, cinco indivíduos de Isochilus linearis (Jacq.) R.Br.. Foram coletadas amostras de todas as raízes das orquídeas e, ainda, da casca do forófito imediatamente abaixo das raízes das orquídeas, bem como da casca do forófito. Após a extração de DNA total, realizou-se a PCR com os pares de primers para fungos em geral (ITS86F+ITS4) e especificamente para Tulasnellaceae (ITS86F+ITS4-Tul). Os amplicons foram sequenciados por NGS (Next Generation Sequencing) pela plataforma Ion Torrent®. Os dados foram analisados e as sequencias identificadas em menor nível taxonômico possível. Também foram analisados pela ANOVA, índices de diversidade e pelas redes neurais artificiais (ANN). Para avaliar o fluxo de carbono, o metabolismo das orquídeas, bem como a estratégia de aquisição de carbono pela orquídea (micoheterotrófica - MH, autotrófica - AT ou mixotrófica – MT), foram feitas coletas de folhas de orquídeas, de espécies não pertencentes à família Orchidaceae e dos pelotons presentes nas raízes das orquídeas, crescendo em diferentes posições nos forófitos. As amostras foram secas até massa constante, moídas e a razão isotópica 13C/12C mensurada por espectrometria de massa de razão isotópica. Os dados obtidos foram submetidos à ANOVA, seguida por análise de agrupamento e de ANN. Observou-se a ocorrência de fungos em geral assim como da família Tulasnellaceae nos diferentes tipos de amostras, principalmente por uma espécie ainda não descrita, Tulasnella sp. 3. A família Tulasnellaceae (42,38 %) demonstrou ser a chave da diversidade em I. lineares bem como nos forófitos associados. Foi observada a presença de fungos previamente descritos em associações com liquens (Pectenia plumbea, Biatora ligni-mollis e Bacidia laurocerasi) o que sugere uma ponte para a entrada de N na associação. Além desses, os fungos Candida smithsonii e Fusarium buharicum apresentaram alta prevalência. Estes fungos já foram descritos em trato intestinais de coleóptero, sugerindo que, auxiliam na dispersão destes fungos quando ocorre a herbivoria das plantas hospedeiras. Não foi observado padrões de dependência do fungo micorrízico por parte da orquídea no gradiente de altimetria, apesar de se ter constatado o fluxo de carbono, e 11,11% das orquídeas apresentarem-se CAM. As orquídeas apresentaram-se como MH, AT e MT, com prevalência de 63,64%, 22,72% e 13,64% respectivamente. Dentre os três indivíduos MT, dois recebem mais C da fotossíntese do que do fungo micorrízico associado. As características fitofisionômicas da área de coleta, como a presença constante de névoa pode explicar a baixa prevalência de orquídeas do tipo CAM, e por se tratar de uma floresta densa, não foi observada diferença no fluxo de carbono, uma vez que se esperava que orquídeas em posições mais elevadas, receberiam mais luz e dependeriam menos do fungo micorrízico. Esse é o primeiro registro de Tulasnellaceae em casca de forófitos e a constatação do fluxo de carbono em orquídeas epífitas tropicais. As informações geradas neste estudo podem dar subsídio para a elaboração de planos de manejo mais eficientes, em que áreas com ocorrência dos fungos potencialmente formadores de micorriza de orquídeas pode ser capaz de sustentar a permanência das espécies.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais