Interação entre β-caroteno e lisozima determinada por espectroscopia de fluorescência e ressonância plasmônica de superfície: comparação termodinâmica e análise cinética | Interaction between β-carotene and lysozyme determined by fluorescence spectroscopy and surface plasmon resonance: thermodynamic comparison and kinetic analysis

Interação entre β-caroteno e lisozima determinada por espectroscopia de fluorescência e ressonância plasmônica de superfície: comparação termodinâmica e análise cinética. Orientadora: Ana Clarissa dos Santos Pires. O β-caroteno (βCAR) é um carotenoide precursor da vitamina A, com poderosa capacidade antioxidante. Além disso, esse carotenoide fornece proteção ao organismo humano de doenças como carcinoma, arteriosclerose, cataratas e úlcera. Entretanto, a sua baixa solubilidade aquosa, sua instabilidade à luz e à elevada temperatura e a baixa biodisponibilidade limitam o seu uso pelas indústrias alimentícias. Uma alternativa para superar essas limitações é o carreamento e proteção do βCAR ao formar complexo com a lisozima (LYS), que apresenta capacidade de carrear moléculas hidrofóbicas. Logo, este trabalho objetivou estudar a interação LYS-βCAR, em diferentes temperaturas e pH 7,4 por meio das técnicas de espectroscopia de fluorescência (FS) e ressonância plasmônica de superfície (SPR). Os resultados encontrados pela técnica de FS indicaram que a formação do complexo LIS-βCAR ocorreu com um coeficiente estequiométrico de 1:1, constante de ligação (K b ) na ordem de 10 5 L mol-¹ , dirigida pelo aumento da entropia do sistema e mantida por interações hidrofóbicas devido os valores positivos de ΔH° e TΔS°. Os valores de ΔG° foram negativos e reduziram com o aumento da temperatura, indicando que no equilíbrio químico LYS + βCAR ⇋ LYS-βCAR o complexo predominou em relação as espécies químicas livres, e a estabilidade do complexo LYS-βCAR foi aumentou ligeiramente com o aumento da temperatura. Os valores de K b encontrados pela técnica de SPR foram da ordem de 10 3 L mol-¹ , ou seja, menor que os encontrados por FS, indicando que o βCAR interage próximos aos Trp62 e Trp108 com constante de ligação maior que ao interagir nos demais sítios da LYS. A análise de SPR também mostrou que os valores de ΔG° foram negativos e com processo de formação do complexo LYS-βCAR entropicamente dirigido. A formação e a dissociação do complexo LYS-βCAR ocorreu em várias etapas, já que as constantes de associação (k a ) e dissociação (k d ) tiveram um comportamento polinomial de segundo grau (R 2 = 0,989 e R 2 = 0,997, respectivamente) com o aumento da temperatura. A formação do complexo intermediário a partir da associação entre as moléculas livres requereu valores de energia de ativação superiores aos necessários para formar o complexo intermediário a partir da dissociação do complexo termodinamicamente estável em todas as temperaturas estudadas. Os demais parâmetros energéticos para associação das moléculas livres e para a dissociação do complexo termodinamicamente estável foram dependente da temperatura, sendo os valores de ΔG ‡ a , ΔG ‡ d , ΔH ‡ a, positivos para todas as temperaturas estudadas. Entre 12 e 20 °C os valores de TΔS ‡ a e ΔH ‡ d foram negativos e entre 24 e 28 °C os valores de TΔS ‡ a e ΔH ‡ d foram positivos, já os valores de TΔS ‡ d foram negativos para todas as temperaturas estudadas. Assim, este estudo obteve os parâmetros termodinâmicos e cinéticos de formação do complexo LYS-βCAR, possibilitando um melhor entendimento de como a LYS pode ser utilizada para proteger e carrear o βCAR, melhorando o uso desse carotenoide pelas indústrias alimentícias e relacionadas. Palavras-chave: β-caroteno. Lisozima. Formação de complexo. Espectroscopia de fluorescência. Ressonância plasmônica de superfície.

β-carotene (βCAR) is a pro-vitamin A carotenoid with powerful antioxidant capacity. Besides, protects the human organism against diseases such as carcinoma, arteriosclerosis, cataracts, and ulcer. However, the low water solubility, light and high temperature instability, and low bioavailability limit the use of βCAR by food industries. An alternative to overcome these limitations is to protect and carrier the βCAR, forming complex with the lysozyme (LYS), which may carrier hydrophobic molecules. Therefore, this work aimed to study LYS-βCAR interaction, at different temperatures and pH 7.4, using fluorescence spectroscopy (FS) and surface plasmon resonance (SPR) methods. FS showed that the LYS-βCAR complex formation occurred with stoichiometric coefficient of 1:1, binding constant (K b ) in the order of 10 5 L mol-¹ , driven by the increase in system entropy and hydrophobic interaction were the main involved in this complex due to positive values of ΔH° and TΔS°. ΔG ° values were negative and decreased as increasing temperature, indicating that in the chemical equilibrium LYS + βCAR ⇋ LYS-βCAR the complex predominated over free chemical species and the stability of the complex LYS-βCAR slightly increased as temperature increased. The K b values found by SPR technique were in the order of 10 3 L mol-¹ , which is less than those found by FS, indicating that βCAR interacts close to Trp62 and Trp108 with a higher binding constant than when interacting in other LYS sites. SPR analysis also showed ΔG° values negative and the LYS-βCAR complex formation entropically driven. The formation and dissociation of the complex LYS-βCAR occurred in multi- step since the association (k a ) and dissociation (k d ) constants had a second-order polynomial behavior (R 2 = 0.989 and R 2 = 0.997, respectively) as temperature increasing. Intermediary complex formation from the association between free molecules required activation energy values higher than those required to form the intermediary complex from the dissociation of the thermodynamically stable at all temperatures studied. The other energetic parameters for the association of free molecules and the dissociation of the thermodynamically stable complex were temperature-dependent, with the values of ΔG ‡ a , ΔG ‡ d , ΔH ‡ a , positive for all temperatures studied. Between 12 and 20 °C the values of TΔS ‡ a and ΔH ‡ d were negative, and between 24 and 28 °C the values of TΔS ‡ a and ΔH ‡ d were positive, whereas the values of TΔS ‡ d were negative for all studied temperatures. Thus, this study obtained the thermodynamic and kinetic parameters of the LYS-βCAR complex formation, allowing a better understanding of how the LYS can be used to protect and carrier βCAR molecule, improving the use of this carotenoid by food industries. Keywords: β-carotene. Lysozyme. Complex formation. Fluorescence spectroscopy. Surface plasmon resonance.

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