Developmental competence of equine oocytes after ICSI : Implications on technical, morphological and cellular aspects

Using equine intracytoplasmic sperm injection (ICSI) procedure, the present study was performed, (i) to study the effect of assisted oocyte activation with calcium ionophore A23187 on developmental competence of oocytes, (ii) to re-evaluate the effect of cumulus morphology on meiotic and developmental competence of oocytes, (iii) to investigate the effect of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) activity on meiotic and developmental competence of oocytes and (iv) to analyze zona pellucida (ZP) properties of equine oocytes of different quality and maturational status, quantitatively by polarization light microscopy. One hour after ICSI, injected oocytes were categorized into two groups: those treated with calcium ionophore A23187 and non-treated group. Cleavage and blastocyst rate were significantly (P<0.05) higher in treated group compared to non-treated group. When we categorized oocytes into expanded (Ex) and compact (Cp), depending on expansion of cumulus cells, meiotic competence after in vitro maturation (IVM) and developmental competence to blastocyst stage after ICSI was significantly (P<0.05) higher in Ex group compared to Cp group. Oocytes stained with brilliant cresyl blue (BCB) dye in order to measure the G6PD activity of the oocytes. Percentage of BCB+ oocytes (blue cytoplasm, low G6PD activity) of Ex group was significantly (P<0.01) higher than that of Cp group. The mean volume of BCB+ oocytes was significantly (P<0.01) higher than the mean volume of BCB– (colorless cytoplasm, high G6PD activity) oocytes. A significantly (P<0.05) higher maturation, cleavage and blastocyst rate were observed in BCB+ group compared to BCB– group. Using a polarization imaging system, ZP were analyzed in oocytes of different developmental competence (i.e., Ex vs. Cp and BCB+ vs. BCB–) and maturational status (i.e., immature, oocytes without and with polar body). Our results revealed that Ex oocytes compared to Cp oocytes and BCB+ oocytes compared to BCB– oocytes had a significantly (P<0.05) thicker ZP and exhibited greater birefringence. In addition, oocytes without polar body showed a significantly (P<0.05) thicker ZP and greater birefringence than both did immature oocytes and oocytes with polar body. In conclusion, activation of equine oocytes by calcium ionophore A23187 is beneficial following conventional ICSI procedure. Our results confirmed that G6PD activity of oocyte before IVM as well as cumulus morphology is a reliable predictor for subsequent development of equine oocytes. Likewise, the extent and pattern of ZP birefringence may constitute a new marker for oocyte quality assessment in equine in vitro embryo production system.

<strong>Die Entwicklungskompetenz equiner Eizellen nach ICSI: technische, morphologische und zelluläre Aspekte inbegriffen</strong><br /> Die vorliegende Studie untersucht den Effekt der assistierten Eizellaktivierung mit Calcium Ionophor A23187 equiner Embryonen nach der intrazytoplasmatischen Spermainjektion (ICSI) auf die Entwicklungskompetenz. Es wurde eine Re-evaluierung des Einflusses der Kumulusmorphologie, der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD) Aktivität und der Beschaffenheit der Zona pellucida mit Hilfe der Polarisationslichtmikroskopie im Hinblick auf die präimplantative Entwicklungskompetenz durchgeführt. Eine Einteilung in zwei Gruppen wurde eine Stunde nach ICSI vorgenommen, wobei nur eine Gruppe mit Calcium- Ionophor A23187 behandelt wurde. Die mit Calcium-Ionophor A23187 behandelten Eizellen zeigten signifikant höhere Teilungs- und Blastozystenraten (P < 0,05) als jene, die nicht behandelt wurden. Die Kumulusmorphologie der ungereiften Eizellen (expandierter Kumulus (Ex) vs. kompaktierter Kumulus (Cp)) zeigte ebenfalls signifikante Unterschiede (P<0,05) in der Maturationsrate und der Blastozystenrate nach ICSI. Zur Messung der G6PD Aktivität der Eizellen wurden diese mit Brilliant Cresyl Blue (BCB) gefärbt. Der prozentuale Anteil der Eizellen mit einer geringeren G6PD-Aktivität und blauem Cytoplasma war in der Gruppe der Ex Eizellen signifikant höher (P<0,01) als in der Gruppe der Cp Eizellen. Des Weiteren wurden signifikant höhere (P<0,05) Maturations- und Entwicklungsraten der BCB+ Eizellen beobachtet verglichen mit Eizellen mit hoher G6PD Aktivität. Mit Hilfe der Polarisationslichtmikroskopie wurde die Zona pellucida der Eizellen mit unterschiedlicher Entwicklungskompetenz (Ex vs. Cp und BCB+ vs. BCB-) und in verschiedenen Reifungsstadien (Immature Eizellen und mature Eizellen mit und ohne Polkörper) vermessen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Ex Eizellen verglichen mit den Cp Eizellen und die BCB+ Eizellen verglichen mit den BCB- Eizellen eine signifikant (P<0,05) dickere Zona pellucida und eine höhere Doppellichtbrechungsintensität aufweisen. Zusätzlich hatten die Eizellen, die nach der in vitro Maturation keinen Polkörper ausschleusten, eine signifikant (P<0,05) dickere Zona pellucida und eine signifikant (P<0,05) höhere Doppellichtbrechungsintensität als immature Eizellen und Eizellen, die einen Polkörper ausschleusten. Zusammenfassend zeigte sich dass sich die Aktivierung der Eizellen nach ICSI mit Calcium-Ionophor A23187 äußerst positiv auf die Entwicklung der equinen Embryonen auswirkt. Kumulusmorphologie wie auch G6PD Aktivität sind verlässliche Indikatoren für die Entwicklungskompetenz. Ebenfalls könnten die Dicke und die Struktur der Zona pellucida, gemessen an Hand der Doppellichtbrechungsintensität, als neue Methode zur Bestimmung des Entwicklungspotentials equiner Eizellen dienen.