Gefäßbildung des bovinen Corpus luteum in vitro | Charakterisierung von Endothelzellen und endothelialen Progenitorzellen | Vascular development of the bovine corpus luteum in vitro | characterization of endothelial cells and endothelial progenitor cells

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Das Corpus luteum ist ein ausgezeichnetes Modell der Blutgefäßentwicklung im adulten Organismus. Für das enorme angiogene Potential dieses Organs fehlt bislang eine Erklärung. In Vorarbeiten isolierte Endothelzellkulturen des bovinen Corpus luteum zeigten unterschiedliche angiogene Potenz (nicht angiogen bis hoch angiogen). Ziel der vorliegenden Arbeit war eine vergleichende Untersuchung dieser funktionell heterogenen Kulturen lutealer mikrovaskulärer Endothelzellen auf morphologischer und molekularer Basis. Dabei sollte auch eruiert werden, ob in den hoch angiogenen Endothelzellkulturen möglicherweise spezialisierte Zellen im Sinne von Stamm- oder Progenitorzellen eine kritische und initiierende Rolle bei der Gefäßentwicklung im Corpus luteum einnehmen. Da die Forschung an adulten Stamm- und Progenitorzellen ein relativ neues Terrain darstellt, existieren bislang keine Untersuchungen zur Beteiligung der genannten Zellen an der Vaskularisierung des Corpus luteum. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit zuerst eine Strategie zur Identifizierung adulter Stammzellen des Rindes erarbeitet. Die immunzytochemische Lokalisation von Stammzellmarkern sowie z.T. deren Nachweis auf Transkriptebene via konventioneller RT-PCR wurde mit der Analyse des spezifischen Wachstumsmusters der Zellen auf lichtmikroskopischer und ultrastruktureller Ebene gekoppelt. Dabei war es essentiell die Koexpression und die Kinetik des Expressionsmusters der eingesetzten Stammzellmarker CD31 (PECAM-1), CD34, VEGF-R1 (flt-1), VEGF-R2 (flk-1, KDR) und CD117 (c-kit, SCF-Rezeptor) zu klären. Für die systematische Charakterisierung der heterogenen Endothelzellkulturen wurden darüber hinaus der immunzytochemische Nachweis der Adhäsionsmoleküle CD29 (betta1-Integrin) und CD51/61 (alphavbetta3 Integrin) durchgeführt. Morphologische Eigenschaften der Zellen wurden mittels phasenkontrast- und transmissionselektronenmikroskopischer Untersuchungen sowie histologischer Untersuchungstechniken beleuchtet. Das Screening der Zellkulturen mit dem genannten Katalog angewandter Methoden ergab folgende Ergebnisse: Eine der Zellkulturen aus dem Corpus luteum in Anbildung kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse als neues Modell der in vitro Vaskulogenese gelten. Diese Kultur zeigte sehr hohe Potenz zur Ausbildung kapillarartiger Strukturen. Die in vitro Gefäßentwicklung wurde hier von Gruppen spezifischer Zellen initiiert, welche charakteristische morphologische Eigenschaften von Progenitorzellen zeigten. Diese Zellen, die als Starting Points bezeichnet wurden, proliferierten intensiv und entwickelten sich zu Zellclustern. Nach Vernetzung der Cluster entstand ein Plexus kapillarartiger Strukturen. Auch die Analyse der spezifischen Zellen auf ultrastruktureller und molekularer Ebene sprach dafür, dass es sich um endotheliale Progenitorzellen handelte. Neue Erkenntnisse zur in vitro Angiogenese wurden durch die Untersuchungen von zwei weiteren Endothelzellkulturen aus dem Corpus luteum cyclicum in Rückbildung erzielt. Beide Kulturen organisierten sich in Form der Angiogenese zu kapillarähnlichen Strukturen. Jedoch zeigten diese Kulturen verschiedene morphologische Phänotypen der Angiogenese. Die vorliegenden Ergebnisse verweisen auf eine unterschiedliche angiogene Aktivität in frühen versus späten Stadien der lutealen Regression. In beiden Kulturen wurden Zellen detektiert, die Stammzellmarker exprimierten. Die Ergebnisse indizieren, dass bestimmte endotheliale Subpopulationen einen plastischen, immaturen Charakter bewahren. In einer weiteren Kultur aus dem Corpus luteum cyclicum in Rückbildung wurden Zellen gefunden, die möglicherweise als potenziell bipotente Vorläuferzellen von Endothel- und Granulosazellen fungieren. Die Zellen dieser Kultur persistierten im zweidimensionalen Monolayerstadium. Zelluläre und molekulare Untersuchungen wiesen deutliche Parallelen charakteristischer Merkmale sowohl von Endothel- als auch von Granulosazellen auf. Lumenbildung endothelialer Stränge wurde bisher nur an Modellen der Angiogenese publiziert. Verschiedene zelluläre Mechanismen, die zur Lumenisierung von Gefäßen führten, wie beispielsweise die Beteiligung von Apoptosen, wurden in dieser Arbeit an den Endothelzellen mit Potenz zur Ausbildung kapillarartiger Strukturen beschrieben. Es manifestierte sich ein wesentlicher Unterschied bei der Lumenisierung zwischen den Kulturen der lutealen An- und Rückbildung. Im Fall der hier beschriebenen vaskulogenen Zellkultur aus dem Corpus luteum cyclicum der Anbildung entstanden tubuläre Strukturen ausgehend von sich vernetzenden Zellclustern endothelialer Progenitorzellen. Dieses Phänomen wurde hier erstmals dokumentiert. Während der Stabilisierungsphase kommt es in vivo bei den meisten Gefäßen zur Anlagerung von Perizyten. Ein interessantes Ergebnis dieser Studie war das abschnittweise Auftreten einer zweiten Zellschicht um die tubulären Strukturen während der Langzeitkultivierung. Möglicherweise könnte es sich hierbei um Perizyten-ähnliche Zellen handeln. Durch die immunzytochemische Markierung der Adhäsionsmoleküle wurde die Dreidimensionalität der Gefäßstrukturen in vitro deutlich dargestellt. Die Kommunikation zwischen den Endothelzellen bzw. zwischen Endothelzellen und extrazellulärer Matrix sowie die Synthese des eigenen dreidimensionalen Substrates wurden in dieser Studie visualisiert. Ein besonderer Befund dieser Arbeit, beobachtet in den lutealen Kulturen mit Potenz zur Ausbildung kapillarartiger Strukturen, war deren determinierte Gefäßarchitektur. Trotz initialer Heterogenität wurden dreidimensionale Netzwerke gefäßähnlicher Strukturen ausgebildet, welche der Architektur des Kapillarbettes im Corpus luteum in vivo entsprachen. Diese Beobachtung, die hier erstmals beschrieben wurde, zeigt, dass in vitro Modelle der Situation in vivo gleichen und daher als Ersatz- und Ergänzungsmethode zu Tierversuchen herangezogen werden können.

The corpus luteum is an excellent model of blood vessel development in the adult organism. Up to now there has been no explanation for the enormous angiogenic potential of this organ. Endothelial cell cultures of the bovine corpus luteum that were isolated in preliminary studies showed different angiogenic potency (high angiogenic to non angiogenic). The aim of the present study was a comparative investigation of these functionally heterogenous cultures on a morphologic and molecular level. It should also be elicited whether in the high angiogenic endothelial cultures potentially specialized cells, i.e. stem and progenitor cells, play a critical and initiating role during vascular development in the corpus luteum. Research on adult stem and progenitor cells represents a relatively new terrain. Therefore a possible participation of these cells in the vascularization of the bovine corpus luteum has not been investigated so far. In the present work a strategy was developed for the identification of stem cells in the adult bovine. The immunocytochemical localization of stem cell markers as well as investigations at the transcriptional level via conventional RT-PCR were linked with the analysis of the specific growth pattern of cells on a light microscopic and ultrastruc-tural level. Thereby it was essential to clarify the coexpression and kinetics of the expression pattern of stem cell markers used, i.e. CD31 (PECAM-1), CD34, VEGF-R1 (flt-1), VEGF-R2 (flk-1, KDR) and CD117 (c-kit, SCF- receptor). In order to characterize systematically the heterogenous endothelial cell cultures the adhe-sion molecules CD29 and CD51/61 were demonstrated immunohistochemically. Morphology of cells was investigated by electron microscopy and histological methods. The screening of the cell cultures with the palette of methods used resulted in the following: One of the cell cultures of the bovine corpus luteum in development can be regarded as new model of in vitro vasculogenesis. In this culture a high potency for the development of capil-lary like structures existed. The in vitro vascular development was initiated by a group of specific cells showing characteristic morphological features of progenitor cells. These cells, which were designated as Starting Points , proliferated intensely and grew cellular clusters. After networking of the clusters, a plexus of capillary like structures was formed. Analysis of specific cells on an ultrastructural and molecular level provided evidence of their character as endothelial progenitor cells. Investigations of two endothelial cell cultures of the corpus luteum in regression resulted in new findings on in vitro angiogenesis. Both cultures were arranged in capillary like structures in the framework of angiogenesis. However these cultures demonstrated different morpho-logical phenotypes of angiogenesis indicating different angiogenic activity in early versus late stages of luteal regression. In both cultures cells expressing stem cell markers were de- tected. These findings suggest that specific endothelial subpopulations retain a plastic and immature nature. In another culture of the corpus luteum cyclicum in regression cells were found that may po-tentially act as bipotent precursors of endothelial and granulosa cells. The cells of this culture persisted in a two-dimensional monolayer. Cellular and molecular analysis showed distinct parallels of attributes of endothelial as well as granulosa cells. Lumenization of endothelial tubes so far has only been stated in models of angiogenesis. In this study different cellular mechanisms of vascular lumenization, like for example involve-ment of apoptosis, were described in endothelial cells that built capillary like structures. A fundamental difference in lumenization between the cultures of luteal development and re- gression became manifest. In the case of the vasculogenic cell culture of the corpus luteum in development the formation of tubular structures started in the cellular clusters of differenti-ated endothelial progenitors. This phenomenon was described for the first time. During the phase of stabilization in vivo in most vessels an attachment of pericytes can be seen. An interesting finding of the present study was the segmental appearance of a second cellular layer around the tubular structures during long term cultivation. This cellular layer could possibly represent pericyte-like cells. Immunocytochemical labelling of adhesion molecules clearly showed three- dimensionality of vascular structures in vitro. The communication between endothelial cells and between endo-thelial cells and the extracellular matrix as well as the synthesis of an own three-dimensional substrate were visualized. A particular finding of this dissertation observed in luteal angio-genic cultures was the determinated architecture of vascular development. Despite initial heterogeneity three dimensional networks of capillary like structures were established that corresponded to the architecture of the capillary bed in the corpus luteum in vivo. This obser- vation that was described for the first time in this study, proves that in vitro models are similar to the situation in vivo and therefore can be used as substitute and supplement methods to animal experiments.