In situ Phänotypisierung von Makrophagen in akuten Entzündungsreaktionen | In situ phenotyping of macrophages in acute inflammatory responses

Makrophagen stellen eine hoch diverse Zellpopulation des angeborenen Immunsystems dar, die modelhaft in proinflammatorisch wirkende M1- oder antiinflammatorische M2-Makrophagen eingeteilt werden. Von Bedeutung ist dies insbesondere beim physiologischen Ablauf von Immunreaktionen, welche sich ebenfalls in eine initiale, entzündungsfördernde Phase und einer sich anschließenden, antiinflammatorischen und heilungsfördernden Phase einteilen lassen und dementsprechend eine zeitassoziierte Dominanz der M1- oder M2-Subtypen zeigen. Bislang sind zwar zahlreiche Marker für die verschiedenen Makrophagen-Phänotypen beschrieben, jedoch beruhen diese zumeist auf In-vitro-Versuchen und sind nicht direkt auf die Situation in vivo übertragbar. Ziel dieser Arbeit war es demnach, ein umfassendes Panel verschiedener Makrophagen-Marker in der Immunhistochemie (IHC) zu entwickeln, um eine Phänotypisierung in situ durchführen zu können und anhand dieser Marker den Zeit-assoziierten Phänotypenwechsel darzustellen. Hierfür wurden 23 verschiedene, publizierte Makrophagen-Marker an murinen FFPE-Gewebeproben (Lunge und Haut) getestet. Eine erfolgreiche Etablierung war jedoch nur für 4 Antikörper (AK) möglich: CD68 (Pan-Marker), iNOS (M1-assoziiert), Arg1 und CD163 (M2-assoziiert), sodass die Beurteilung des Phänotypenwechsels ebenfalls nur eingeschränkt durchführbar war und eine umfangreiche Phänotypisierung von Makrophagen in der IHC weiterhin herausfordernd bleibt. Die etablierten AK wurden an Archivmaterial von zwei Bakterien-induzierten, murinen Pneumoniemodellen (Infektionen mit gramnegativen Acinetobacter baumannii (AcB) und grampositiven Staphylococcus aureus (Staph)) zu den Zeitpunkten 24 bzw. 48 h post infectionem eingesetzt und anschließend digital mit Hilfe von Algorithmen ausgewertet. Signifikante Zeit-assoziierte Veränderungen der Expression konnten dabei lediglich für Arg1 im AcB-Modell nachgewiesen werden, wobei sich hier, wie erwartet, ein Anstieg der Arg1-positiven Zellzahlen pro mm² in den entzündlich veränderten Bereichen von 24 zu 48 h hin zeigte. Für iNOS und CD163 waren hingegen keine deutlichen Zeit-assoziierten Veränderungen in den Modellen erkennbar. Dennoch konnte eine umfangreiche Analyse der Verteilung und Expressionshäufigkeit von CD68, Arg1, iNOS und CD163 in den beiden Pneumoniemodellen durchgeführt werden, wozu bislang keine vergleichbaren Studien bekannt sind. Hierbei konnte in den entzündeten Bereichen insbesondere im AcB-Modell eine vermehrte Expression von Arg1 und im Gegensatz zum Staph-Modell auch von iNOS nachgewiesen werden. Auffallend war weiterhin das fast ausschließlich peribronchiale und perivaskuläre Verteilungsmuster der CD163-positiven Zellen, welches sich deutlich von den anderen AK unterschied. Die genaue Rolle und Bedeutung der hier beobachteten Expressionen übersteigt jedoch den Rahmen dieser Studie und muss erst noch geklärt werden.

Macrophages represent a highly diverse cell population of the innate immune system, which are modelled as proinflammatory M1 or anti-inflammatory M2 macrophages. This is of particular importance in the physiological course of immune reactions, which can also be divided into an initial, proinflammatory phase and a subsequent, anti-inflammatory and healing-promoting phase and accordingly show a time-associated dominance of the M1 or M2 subtypes. To date, numerous markers for the different macrophage phenotypes have been described, but these are mostly based on in vitro experiments and are not directly transferable to the situation in vivo. Accordingly, the aim of this work was to develop a comprehensive panel of different macrophage markers in immunohistochemistry (IHC) in order to perform phenotyping in situ and to visualize time-associated phenotype change based on these markers. For this purpose, 23 different published macrophage markers were tested on murine FFPE tissue samples (lung and skin). However, successful establishment was only possible for 4 antibodies (Ab): CD68 (pan marker), iNOS (M1-associated), Arg1 and CD163 (M2-associated), so assessment of phenotype switch was also limited and comprehensive phenotyping of macrophages in IHC remains challenging. Established Ab were used on archival material from two bacteria-induced murine pneumonia models (infections with Gram-negative Acinetobacter baumannii (AcB) and Gram-positive Staphylococcus aureus (Staph)) at time points 24 and 48 h postinfection and subsequently evaluated digitally using algorithms. Significant time-associated changes in expression could only be detected for Arg1 in the AcB model, which, as expected, showed an increase in Arg1-positive cell numbers per mm² in the inflammation-altered areas from 24 to 48 h. In contrast, for iNOS and CD163, no clear time-associated changes were evident in the models. Nevertheless, a comprehensive analysis of the distribution and expression frequency of CD68, Arg1, iNOS, and CD163 in the two pneumonia models could be performed, for which no comparable studies are known so far. Here, an increased expression of Arg1 and, in contrast to the Staph model, also of iNOS could be detected in the inflamed areas, especially in the AcB model. Furthermore, the almost exclusively peribronchial and perivascular distribution pattern of the CD163-positive cells was strikingly different from the other Ab. However, the exact role and significance of the expressions observed here are beyond the scope of this study and remain to be elucidated.