UNTERSUCHUNGEN ZUM NACHWEIS UND ZUR BIOTRANSFORMATION EINIGER ORAL WIRKSAMER 17α-ALKYL-STEROIDE MIT ANABOLER WIRKUNG BEIM PFERD | Metabolism and analysis of selected orally-active 17α-alkyl Steroids with anabolic potential in the horse

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Die vorliegende Studie befaßte sich mit der Aufklärung der Verstoffwechselung von Dehydroepiandrosteron (DHA), Methandriol (MAD) und 17α-Methyltestosteron (17α-MT) beim Pferd. Ein weiteres Ziel war darüber hinaus, für die beiden letzteren, oral-wirksamen Steroide mit anaboler Wirkung eine routinemäßig anwendbare Screening-Methode im Rahmen der Dopinganalytik zu entwickeln. Dazu wurden jeweils zwei im Training befindlichen Vollblutrennpferden gleiche Mengen (200 mg) eines Substanzgemisches der zu untersuchenden Steroidderivate verabreicht. Für DHA und MAD bestanden diese Gemische zu gleichen Teilen aus deuterierten und nicht-deuterierten Molekülen, sowie einem radioaktiv- markierten Isotop (3H-DHA, 14C-DHA, 3H-MAD). 17α-MT wurde lediglich als deuteriertes / nicht-deuteriertes Substanzgemisch verabreicht. Während drei bis fünf Tagen nach der Applikation wurden in regelmäßigen Abständen Blutproben entnommen, sowie der frei abgesetzte Urin gewonnen. Durch Ermittlung der emittierten ß-Strahlung in den gesammelten Proben, wurden Resorptions- und Eliminationsverhalten der untersuchten Steroide bestimmt. Zur labortechnischen Extraktion und anschließenden gaschromatographischen / massenspektrometrischen (gc/ms)-analytischen Untersuchung gelangten im Rahmen dieser Arbeit dann lediglich die gesammelten Urinproben. Die Halbwertszeit in der Eliminationsphase betrug für intramuskulär verabreichtes 3H-DHA zwischen 9 bis 12 Stunden. Die Halbwertszeit des oral verabreichten 14C-DHA lag bei beiden Pferden bei etwa 3 Stunden. Sie war damit 3 4 mal geringer als bei intramuskulär verabreichtem DHA. Dies dürfte hauptsächlich durch einen ausgeprägten hepatischen first-pass effect bei oraler Applikation von 14C- DHA zu erklären sein. Die Halbwertszeit des oral verabreichten Methandriol betrug bei einem Pferd 11,99 h und entsprach damit etwa der, von intramuskulär appliziertem 3H-DHA, d.h. die 17α-Alkylierung stellt vermutlich einen wirksamen Schutz gegen den first-pass effect der Leber dar. Bei dem zweiten Pferd betrug die Halbwertszeit von oral verabreichtem 3H-MAD mit 3,75 h jedoch nur etwa ein Drittel dieses Wertes und war damit eher der Halbwertszeit von oral verabreichtem 14C-DHA vergleichbar, welches einem first-pass effect unterlag. Eine Erklärung für diesen großen Unterschied in den Halbwertszeiten konnte nicht gegeben werden. Die mit dem Urin insgesamt ausgeschiedene Menge an intramuskulär appliziertem 3H-DHA betrug etwa 60% der verabreichten Gesamtdosis. Bei oral verabreichtem 14C-DHA und 3H-MAD lag dieser Wert bei etwa 50%. Der Verlauf der Urinausscheidung von 3H-MAD-Äquivalenten glich jedoch bei beiden Pferden eher dem, von intramuskulär verabreichtem 3H-DHA. Bei beiden Steroiden war der Zeitpunkt, zu dem ≥ 95% der über den Urin ausgeschiedenen Dosis angefallen waren, erst nach etwa 50 Stunden erreicht, während dies für oral verabreichtes 14C-DHA bereits nach 30 35 Stunden der Fall war. Bei der Aufarbeitung des mit radioaktivem DHA und MAD markierten Urins kam es zu großen Verlusten an Radioaktivität und damit an Analysesubstanz. Diese konnten, trotz mehrfacher Änderung der angewendeten Extraktionsmethode, nicht wesentlich reduziert werden: Ein Großteil der verlorenen Radioaktivität fand sich (1) im Anschluß an die Extraktion noch im Urin, ein weiterer Teil (2) in verschiedenen Lösungen, welche zum Waschen der Analyseextrakte verwendet worden waren. Die Ursache dieses Phänomens konnte nicht eindeutig ermittelt werden. Es wurde jedoch die Hypothese aufgestellt, daß (1) zumindest teilweise durch die ungenügende Kapazität, der zur Extraktion verwendeten Kartuschen verursacht wurden, während (2) auf das Vorkommen eines / mehrerer stark hydrophiler Metaboliten zurückzuführen sei, welche durch die verwendeten hydrophilen Lösungen aus dem lipophilen Extrakten ausgewaschen wurden. Generell läßt sich feststellen, daß DHA nur zu einem sehr geringen Anteil unkonjugiert über den Harnweg ausgeschieden wurde (< 2%). Der weitaus größte Anteil wurde als Konjugat ausgeschieden. Es erfolgte eine Konjugation zum geringeren Teil mit Glucuronsäure (10-15%) und zum weitaus größeren Teil mit Schwefelsäure (60%). Auch MAD wurde nur zu einem geringen Prozentsatz in unkonjugierter Form ausgeschieden (< 4%). Ein Anteil von 10-15% der Metaboliten wurde als Glucuronsäure-Konjugat ausgeschieden. Der weitaus größte Teil der bestimmbaren Metaboliten wurde auch in diesem Falle als Schwefelsäure-Konjugat ausgeschieden (50%). Die gc/ms-Analyse der DHA- und MAD-Extrakte zeigte aufgrund dieser Verluste nur eine geringe Konzentration der einzelnen, auffindbaren Metaboliten. Für DHA konnten folgende drei Metaboliten einwandfrei bestimmt werden: 1\. 3ß-Hydroxyandrost-5-en-17-on 2\. 5-Androsten-3,17-diol 3\. 5-Androstan-3,17-diol Für MAD konnten folgende fünf Metaboliten einwandfrei bestimmt werden: 1\. 17α-Methyl-5-androsten-3ß,17ß- diol 2\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androstan-3ß-ol 3\. 17-Hydroxy-17α- methyl-5-androstan-3,(15/16)-diol 4\. 17-Hydroxy-17α- methyl-5-androstan-3,(6/7),16-triol 5\. 17-Hydroxy-17α-methyl- androst-4-en-(6/7),16-diol-3-on Da im Falle des 17α-MT keine radioaktiven Isotope verabreicht worden waren, unterblieb eine estimmung der pharmakokinetischen Parameter bei diesem Steroid. Bei der gc/ms-Analyse der Urin-Extrakte nach oraler Gabe von 17α-MT konnten zahlreiche Metaboliten gefunden werden, welche z.T. in sehr hoher Konzentration in den Analyseflüssigkeiten vorkamen. Es wurde deshalb angenommen, daß 17α-MT die für DHA und MAD beschriebenen Verluste nicht oder nur in sehr viel geringerem Ausmaß aufwies. Für 17α-MT konnten folgende 12 Metaboliten einwandfrei bestimmt werden: 1\. 17α-Methyl-17ß-hydroxy-4-androsten-3-on 2\. 17-Hydroxy- 17α-methyl-5-androstan-3-ol 3\. 17-Hydroxy-17α- methyl-5-androstan-(6/7)-ol-3-on 4\. 17-Hydroxy-17α- methylandrost-4-en-(6/7)-ol-3-on 5\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androstan-3,(6/7 bzw. 15/16)-diol 6\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androst-3,(6/7)-diol 7\. 17 -Hydroxy-17α-methyl-5-androstan-3,16-diol 8\. 17-Hydroxy-17α- methyl-5-androstan-3,(6/7),(15/16)-triol 9\. 17-Hydroxy-17α- methyl-5-androstan-3,(6/7),16-triol 10\. 17-Hydroxy-17α-methyl- androst-4-en-3,(6/7),(15/16)-triol 11\. 17-Hydroxy-17α-methyl- androst-4-en-(6/7),16-diol-3-on 12\. 17-Hydroxy-17α- methyl-5-androstan-(6/7),(15/16)-diol-3-on Voraussetzung für die Etablierung einer routinemäßigen Nachweismethode für MAD ist die Optimierung des Extraktionsverfahrens, welches unter den gegebenen Bedingungen nicht für ein Screening-Verfahren geeignet ist. Für 17α-MT dagegen erwiesen sich die Metaboliten 2, 6, 7 und 9 als geeignet, bei der gc/ms-Sreening-Analyse eine mißbräuchliche Anwendung dieses Stoffes beim Pferd nachzuweisen. Mit Hilfe des 'Single Ion Monitoring (SIM)' sollte auf die für 17α-methylierte Steroide charakteristischen Ionen m/z 143, m/z 218 und m/z 231 untersucht werden. Diese Methode ermöglicht den Nachweis einer 17α-MT-Anwendung (zu Dopingzwecken) bis zu einem Zeitraum von mindestens 50 h nach der Applikation. Da im Rahmen dieser Studie über diesen Zeitraum hinaus keine Urinproben mehr gewonnen worden waren, sind weitergehende Untersuchungen nötig, um zu bestimmen, bis zu welchem Zeitpunkt nach der Applikation ein Nachweis der mißbräuchlichen Anwendung von 17α MT mittels der hier beschriebenen Methode längstens möglich ist.

This study tried to investigate the metabolism of the anabolic steroids dehydroepiandrosterone (DHA), methandriol (MAD) and 17α-methyltestosterone (17α-MT) in the Equine and to subsequently develop a gas-chromatographic / mass-spectrometric (gc/ms) screening method for the detection of the two latter orally-active anabolic agents. For each experiment 200 mg of the respective steroid were administered to two thoroughbred horses in training. The administered substances contained a mixture of the same amount of deuterated and non-deuterated steroid. Additionally, a radioactive isotop was administered in the DHA (3H-DHA and 14C-DHA) and MAD (3H-MAD) studies. In the case of 17α-MT no radioactive isotop was administered. Blood samples were taken at regular intervals for a three- up to a five-day period. Freely- voided urine was collected for the same period of time. The absorption and elimination of the administered steroids were determined by scintigraphy of the ß-emission in all radio labelled samples collected. Only the urine samples were subsequently extracted for the detection of possible steroid metabolites by gc/ms-analysis. The half-life of intramuscularly administered 3H-DHA ranged from between 9 to 12 h. The half-life of orally administered 14C-DHA was around 3 h in both horses and hence about ¼ to ⅓ that of 3H-DHA. This can mainly be explained by the first-pass effect to which orally administered 14C- DHA had been exposed in the liver. The half-life of orally administered 3H-MAD was 11.99 h for one of the two horses. This value is similar to the one for intramuscularly administered 3H-DHA. This would indicate that the 17α- alkylation has protected the orally administered MAD from the first-pass effect of the liver. For the second horse the half-life was only 3.75 h, which is similar to the one for orally administered 14C-DHA being exposed to the first-pass effect of the liver. This large difference in half-life could not be explained. Overall, about 60% of the total intramuscularly administered 3H- DHA was excreted via the urine. For orally administered 14C-DHA and 3H-MAD this value was about 50%. In 3H-DHA and 3H-MAD ≥95% of the radioactive dose excreted via the urine had been excreted only after 50 h. For 14C-DHA this value had already been reached between 30-35 h after administration of the steroid. The urinalysis of the radioactively labelled steroids showed great losses of radioactivity, i.e., of steroid metabolites in the urine after extraction as well as in the solutions used for washing the extracts. Two main reasons were assumed for these losses: (1) it was thought that losses which occurred into the urine after extraction were at least partly caused by capacity problems of the cartridges used; whereas (2) losses into solutions used for washing the different extracts might have their origin in the existence of a number of very polar metabolite(s), which were hence washed out of the lipophilic extracts by the hydrophilic wash solutions used. Due to these losses the gc/ms analysis of DHA and MAD partly showed rather unsatisfactory results; most of the detected metabolites were only present in very low concentrations. This resulted in difficulties to assign the appropriate chemical structure to a number of the detected metabolites. In general, DHA and its metabolites were excreted only to a very low percentage as free steroids (< 2%). About 10-15% were excreted as conjugates with glucuronic acid while around 60% of the metabolites showed a conjugation with sulphuric acid. The excretion pattern of MAD and its metabolites showed similar results; where only around 4% were excreted as free steroid, while 10-15% were excreted as conjugates of glucuronic acid and around 50% as conjugates of sulphuric acid. The following three metabolites have been determined for DHA: 1\. 3ß-Hydroxyandrost-5-en-17-one (I = parent drug), 2\. 5-Androsten-3,17-diol (II/4 isomers), and 3\. 5-Androstane-3,17-diol (III/2 isomers). The following five metabolites have been determined for MAD: 1\. 17α-Methyl-5-androsten-3ß,17ß-diol (I/2 isomers = parent drug), 2\. 17 -Hydroxy-17α-Methyl-5-androstane-3ß-ol (II), 3\. 17-Hydroxy-17α- Methyl-5-androstane-3,(15/16)-diol (IV), 4\. 17-Hydroxy-17α- Methyl-5-androstane-3,(6/7),16-triol (V/2 isomers), 5\. 17-Hydroxy-17α-Methyl- androst-4-en-(6/7),16-diol-3-one (VI), as well as Since in the case of 17α-MT no radioactively labelled isotope had been administered no information could be obtained about the absorption or excretion profile, the plasma half-life of the substance or the extent of its phase-II metabolism in the horse. The gc/ms analysis of this steroid though showed a large number of metabolites present in the analysed extracts in viable concentrations. It was therefore assumed that the losses during urinalysis as described for DHA and MAD did not occur at all or only to a much lesser extend in the case of 17α-MT. The following 12 metabolites have been determined for 17α-MT: 1\. 17α-Methyl-17ß- Hydroxy-4-androsten-3-one 2\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androstane-3-ol 3\. 17 -Hydroxy-17α-methyl-5-androstane-(6/7)-ol-3-one 4\. 17-Hydroxy-17α-methyl- androst-4-en-(6/7)-ol-3-one 5\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androstane-3,(6/7 or 15/16)-diol 6\. 17-Hydroxy-17α-methyl-5-androst-3,(6/7)-diol 7\. 17-Hydroxy- 17α-methyl-5-androstane-3,16-diol 8\. 17-Hydroxy-17α- methyl-5-androstane-3,(6/7),(15/16)-triol 9\. 17-Hydroxy-17α- methyl-5-androstane-3,(6/7),16-triol 10\. 17-Hydroxy-17α-methyl- androst-4-en-3,(6/7),(15/16)-triol 11\. 17-Hydroxy-17α-methyl- androst-4-en-(6/7),16-diol-3-one 12\. 17-Hydroxy-17α- methyl-5-androstane-(6/7),(15/16)-diol-3-one For MAD the prerequisite for the establishment of a routine detection method is the optimization of the method used, which in its current form does not yet yield sufficient results viable to be included into a screening-analysis procedure. For 17α-MT instead the search for metabolites 2, 6, 7 and 9 during a routine gc/ms screening analysis is considered sufficient to prove the administration of 17α-MT to the horse for doping purposes. Using 'single ion monitoring (SIM)' it should be screened for the fragment ions with the mass-to-charge (m/z) ratios m/z 143, m/z 218 and m/z 231 since they are characteristic for all 17α-methylated steroids. This method allows the detection of a 17α-MT application to the horse for a period of at least 50 h after administration. Since in the course of this study no later urine samples had been collected, additional studies will be needed to determine the maximum time of detection after administration of 17α- MT to a horse for doping purposes when using this method of extraction and analysis.