Identification and quantification of regional expression of members of the NADPH oxidase (NOX) enzyme family during the estrous cycles in the bovine oviduct | Identifizierung und Quantifizierung der regionalen Expression von Vertretern der NADPH Oxidase (NOX) Enzym-Familie während des Sexualzyklus im bovinen Ovidukt

Oviductal samples from 28 cows were used to examine the expression of NADPH oxidase (NOX) enzymes and their activation subunits in the bovine oviduct during the estrous cycle. The regional expression pattern of NOX enzymes in oviducts from ipsi- and contra-lateral site was also investigated. Bovine oviducts collected from the slaughterhouse were classified into 4 groups: post- ovulatory (day 1-5), early-to-mid luteal (day 6-12), late luteal (day 13-18), and pre-ovulatory (day 19-21) phases. For each phase ipsi- and contra- lateral oviducts were identified according to ovulation side and further sub- divided into two separate regions, the ampulla and isthmus. Thereafter, the oviductal mucosa was recovered separately from ampulla and isthmus. For in vitro investigation of NOX enzymes mRNA expression, a primary oviductal cells culture was used. The cells were stimulated for 6h with physiological concentrations of E2 (10pg/ml), P4 (10ng/ml), AA (10µM) or PGE2 (0.25µM). Samples were collected for RNA isolation with intervals of 2 hours at time points 0h, 2h, 4h, or 6h of treatment. Cell cultures without hormonal treatment were used as control for each of the time points. For the first time NOX and their activation subunits were found expressed in oviductal mucosal cells in ampulla and isthmus of ipsi- and contra-lateral oviduct throughout the estrus cycle. Only DUOX2 was absent in bovine oviductal mucosa confirmed by detection of its mRNA in bovine endometrial cells. NOX1, NOX2 and DUOX1 showed non-estrous cycle-dependant expression pattern, while mRNA expression of NOX4 and NOX5 were estrous cycle-dependant. NOX4 and NOX5 showed distinct expression pattern: NOX4 mRNA was up-regulated during the pre- and post- ovulatory phase, while the level of NOX5 mRNA expression was increased after ovulation and during early-to-mid luteal phase. In addition, NOX5 mRNA has a significant regional expression during post-ovulatory phase: its mRNA is up- regulated in the isthmus of ipsi-lateral oviduct compared to ampulla. Furthermore, all mRNA of the NOX subunits (p22phox, p67phox, p47phox, p40phox) were continuously detected without any significant difference between the different regions of oviduct during the estrous cycle. These subunits seemed to be expressed equally between the different phases of the estrous cycle and showed a positive correlation with expression levels of NOX1, NOX2. Furthermore, NOX4 has a strong positive correlation with its activating subunits p22phox during the post-ovulatory phase. For the in vitro expression, all NOX enzyme components were detected in the untreated and treated primary oviductal cell cultures. E2 or P4 treatments resulted in an up-regulation of some NOX components, namely NOX2, p22phox and p47phox, while DUOX1 mRNA expression was up-regulated under P4 treatment and down-regulated by E2. One observation is that NOX5 mRNA was undetectable in untreated cells or treated cells during the whole experimental period. Generally, AA as well as PGE2 treatments showed no significant effects on the expression of NOX enzymes, although AA treatment significantly down-regulates mRNA expression of p67phox and p47phox while PGE2 induces up-regulation of p22phox and p47phox. The obtained expression pattern of NOX components during the estrous cycle pointed to NOX enzymes as a novel source for balanced ROS levels in the oviductal environment. The enzyme activity may be regulated by endocrine and/or local factors. Presence of NOX subunits with distinct expression pattern and its responses in cell culture could be point towards precise mechanisms to regulate NOX activities. Moreover, ROS was implicated in early reproductive events occurring in oviduct and may play important new roles in physiological and pathological effects in the female reproductive tract. This leads to the hypothesis that providing controlled levels of these molecules have benefits on oocyte maturation, spermatozoa function, fertilization and early embryo development in the cow.

Von 28 Kühen wurden Ovidukte verwendet um die Expression der NADPH-Oxidase (NOX)-Enzyme und deren Aktivierungsuntereinheiten während des Sexualzyklus zu untersuchen. Das Expressionsmuster der NOX-Enzyme in den verschiedenen Regionen des Oviduktes wurde ebenfalls untersucht. Bovine Ovidukte wurden am Schlachthof gewonnen und in 4 Gruppen eingeteilt: post-ovulatorische Phase (Tag 1-5), frühe-mittlere Lutealphase (Tag 6-12), späte Lutealphase (Tag 13-18) und prä-ovulatorische Phase (Tag 19-21). Für jede Phase wurden ipsilatereale (Seite der Ovulation bzw. mit Corpus Luteum) und kontralaterale Ovidukte gewonnen und weiter eingeteilt in die Abschnitte Ampulle oder Isthmus. Danach wurde die Oviduktmukosaschicht von den einzelnen Abschnitten gewonnen. Für in vitro-Untersuchungen der mRNA-Expression der NOX-Enzyme wurde eine Ovidukt-Primärzellkultur verwendet. Die Zellen wurden für 6h mit physiologischen Konzentrationen von E2 (10pg/ml), P4 (10ng/ml), AA (10µM) oder PGE2 (0.25µM) behandelt. Proben wurden für die RNA-Isolierung im Abstand von 2 Stunden gewonnen zu den folgenden Zeitpunkten: 0h, 2h, 4h, oder 6h. Zellkulturen ohne Hormonbehandlung wurden als Kontrollen zu diesen Zeitpunkten verwendet. Zum ersten Mal wurde die Expression von NOX und deren Aktivierungsuntereinheiten in allen Regionen des bovinen Oviduktes während des Sexualzykluses dektektiert. Nur DUOX2 mRNA konnte im bovinen Ovidukt nicht nachgewiesen werden, sehr wohl aber in bovinen Endometriumszellen. NOX1, NOX2 und DUOX1 zeigten kein sexualzyklusabhängiges Expressionsmuster im Ovidukt, während die mRNA-Expression von NOX4 und NOX5 zyklusabhängig war. NOX4 und NOX5 zeigten folgende spezifische Expressionsmuster: NOX4 mRNA-Expression war während der prä- und post-ovulatorischen Phase erhöht verglichen mit der Lutealphase. Dagegen stieg die NOX5 mRNA-Expression nach der Ovulation und während der frühen-mittleren Lutealphase an. Zusätzlich zeigte die NOX5 mRNA- Expression ein lokal-spezifisches Expressionsmuster während der post- ovulatorischen Phase. NOX5 mRNA-Gehalte waren im Isthmus des ipsi-lateralen Oviduktes hochreguliert verglichen mit der Ampulle. Die mRNA der NOX- Unterheinheiten (p22phox, p67phox, p47phox, p40phox) wurden auf konstanten Niveau in den verschiedenen Regionen des Oviduktes exprimiert als auch während des Sexualzykluses. Die mRNA-Expression dieser NOX-Untereinheiten zeigte eine positive Korrelation mit der Expression von NOX1 und NOX2. NOX4 wies auch eine starke positive Korrelation mit seiner Aktivierungseinheit p22phox während der post-ovulatorischen Phase auf. mRNA-Expression für fast alle NOX-Enzym- Komponenten wurden in in vitro-Experimenten gefunden, sowohl in unbehandelten als auch behandelten Primär-Oviduktzellkulturen. E2-oder P4-Behandlung resultierte in einer Hochregulierung von einigen NOX-Enzym-Komponenten: NOX2, p22phox und p47phox. DUOX1 mRNA-Expression hingegen wurde unter P4-Behandlung erhöht und durch E2-Behandlung erniedrigt. Im Gegensatz dazu konnte keine NOX5 mRNA während der gesamten Zeit in unbehandelten oder behandelten Zellen nachgewiesen werden. Meistens zeigte die Behandlung der Zellen mit AA oder PGE2 keine signifikanten Effekte auf die Expression der NOX-Enzyme. Ausnahmen war die Abschwächung der mRNA-Expression von p67phox und p47phox durch AA, während PGE2 eine Erhöhung der mRNA-Expression von p22phox und p47phox induzierte. Die erhaltenen Expressionsdaten der NOX-Enzym-Komponenten im Ovidukt während des Sexualzykluses deuten darauf hin, dass NOX-Enzyme eine neue Quelle für eine regulierte ROS-Konzentration im Ovidukt sind. Die Enzymaktivität kann durch endokrine oder lokale Faktoren reguliert werden. Die Anwesenheit der NOX-Untereinheiten und ihre Regulation auf Hormone in Zellkulturexperimenten deuten auf einen fein regulierten Mechanismus hin um die NOX-Aktivität zu steuern. ROS ist involviert in frühe Vorgänge der Reproduktion, die im Ovidukt vonstatten gehen und spielen möglicherweise eine wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Vorgängen im weiblichen Reproduktionstrakt. Dies führt zu der Hypothese, dass diese Komponenten unter genauer Kontrolle einen positiven Einfluss auf Oozytenreifung, Spermienfunktion, Befruchtung und Entwicklung des frühen Embryos in der Kuh spielen können.